In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten

Astrozyten spielen zahlreiche wichtige Funktionen in der Gehirnentwicklung und Physiologie¹. Neben ihrer Rolle an der Blut – Hirn-Schranke, wo sie die Nährstoffaufnahme und den Blutfluss regulieren, tragen sie aktiv zur Synapsenbildung und -funktion bei und produzieren Neuromodulatoren, die die neuronale Aktivität und das Verhalten verändern können². Darüber hinaus trägt Astrozytendysfunktion zu einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen³. Astrozyten in der Großhirnrinde zeigen eine ausgeklügelte Morphologie, die einen umfassenden Kontakt mit neuronalen Prozessen ermöglicht. Diese Kontakte, die für die Schaltungsfunktion unerlässlich sind, steuern auch die Astrozytenmorphogenese und Synaptogenese durch Zelladhäianionsproteine⁴. Neurowissenschaftler benötigen bequeme und robuste Werkzeuge, um die Entwicklung von Astrozyten und die Morphogenese in ihren neurologischen Modellen von Interesse zu untersuchen. Aufgrund der engen Aneignung von Astrozyten an ihre Nachbarn und ihrer einheitlichen dreidimensionalen Fliesen ist es jedoch schwierig, kortikale Astrozyten herauszuarbeiten und ihre Morphologie mit Immunmarkern umfassend zu bewerten.

Derzeit ermöglichen zwei hauptgenetische Strategien die Kennzeichnung und Individualisierung kortikaler Astrozyten in situ: spärliche Reporteraktivierung in transgenen Mauslinien oder somatische Transgenese mittels Elektroporation von Reporterplasmiden. Die erste Strategie beruht auf der Züchtung einer floxierten Reporter-Mauslinie mit Mäusen, die eine induzierbare Form der Cre-Rekombimeinase ausdrücken, die speziell in Astrozyten bei Dertoxifen-Lieferung aktiviert wird (z. B. Aldh1l1-CreERT2⁵). Mit dieser Strategie sind mehrere Nachteile verbunden. Erstens erfordert die Zucht von transgenen Mäusen eine große Anzahl von Tieren und mehrere Tests sind in der Regel erforderlich, um die richtige Dosis von Tamoxifen zu bestimmen, um eine ausreichend spärliche Kennzeichnung kortikaler Astrozyten zu ermöglichen. Die Analyse kortikaler Astrozytenphänotypen in einem genetischen Mausmodell von Interesse erfordert noch mehr Züchtung und Mauskonsum. Darüber hinaus ist bei der Utero-Tamoxifen-Injektion bekannt, die mit der Parturtion zu stören, was diese Strategie schwierig macht, auf die Untersuchung der frühesten Stadien der Astrozytenentwicklung anzuwenden. In vivo DNA Elektroporation ist eine alternative tamoxifenfreie Strategie, die auf einer Minimalanzahl von Tieren beruht⁶. Dieser Ansatz, der entweder in embryonalen oder postnatalen Stadien durchgeführt wird, besteht darin, Reporterplasmide in die seitlichen Ventrikel von Nagetieren zu injizieren, gefolgt von elektrischen Impulsen, die Poren in der Zellmembran erzeugen, wodurch DIE DNA in Vorläuferzellen eindringen kann, die den Ventrikel aussäumen. Anschließend werden die von den elektroporated Plasmiden getragenen Reportertransgene von der Zielzellmaschinerie verarbeitet und⁷ausgedrückt. Zwei Elektroporationsmethoden wurden zuvor beschrieben, um kortikale Astrozyten der Maus zu kennzeichnen: 1) Postnatale Astrozytenkennzeichnung durch Elektroporation (PALE), die auf der Elektroporation von 1-2 einfarbigen episomalen Reporterplasmiden in frühen postnatalen Stadien⁴beruht; 2) Die StarTrack-Strategie basiert auf der in utero Elektroporation (IUE) von mehreren einfarbigen integrativen Reporterplasmiden^8,9,10. Obwohl diese beiden Techniken PrA in der Großhirnrinde effizient kennzeichnen, stellen sie auch einige Einschränkungen dar. In ihrer ursprünglichen Version stützen sich beide Methoden auf einen glialfibrillären sauren Protein (GFAP) Promotor, um die Expression in Astrozyten anzutreiben, was die Kennzeichnung in Richtung radialer Glia sowie pialer und reaktiver Astrozyten verzerrt, die GFAP stärker ausdrücken als normale ruhende PrA^11,12. In Bezug auf PALE sind andere Nachteile das späte Stadium der Elektroporation, das die Kennzeichnung von frühgeborener PrA (oder solche, die von frühen delainierenden Vorläufern stammen) und die Analyse der frühen Stadien der Astrogliaentwicklung verhindert, und die Verwendung von episomalen Vektoren, die durch aufeinander folgende Divisionen während der massiven Proliferation, die PrA während der ersten postnatalen Woche^13,14durch sich verdünnt, verhindert. Im Gegensatz zu PALE basiert StarTrack auf der embryonalen Elektroporation integrativer Reporterplasmide, die es ermöglichen, den Beitrag embryonaler und postnataler Vorfahren zu PrA zu verfolgen. Ein aktualisiertes StarTrack-Schema, das sich auf den Ubiquitin C-Promoter (UbC-StarTrack) stützt, erreicht eine breitere Expression fluoreszierender Reporter sowohl im neuronalen als auch im glialischen Abstieg (einschließlich Astrozyten) der neuronalen Vorläufer^15,16,17. In seiner aktuellen Fassung ist die Umsetzung dieses Ansatzes jedoch komplex, da er auf einer äquimolaren Mischung von 12 verschiedenen Plasmiden beruht, die sechs fluoreszierende Proteine (FP) mit teilweiser Anregung und Emissionsspektren überlappen.

Präsentiert wird hier eine einfache in utero Elektroporation-basierte Multicolor-Etikettierungsmethode mit integrativen Reporterkonstrukten, die von einem starken und breit aktiven Promotor angetrieben werden, um kortikale Astrozyten herauszuarbeiten¹⁴. Darüber hinaus wird eine einfache Bildanalyse-Pipeline mit lizenzierten (z.B. Imaris) und Open Access (Vaa3D^18,19,20) Bildanalyse-Software zur Segmentierung von Astrozyten-Territorialvolumen bzw. Arborisierung zur Verfügung gestellt. Im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Methoden stützt sich diese Strategie ausschließlich auf 1–2 mehrfarbige integrative Transgene Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers oder MM²¹), die auf das zytoplasmatische und (optional) Kernzellkompartiment gerichtet sind, dessen Expression von einem synthetischen CAG-Promotor angetrieben wird, der aus einem Cytomegalievirus-Enhancer, einem Huhn-β-Aktin-Promotor und einem Kaninchen-β-Globin-Spleis-Akzeptier-Site besteht. Dies ermöglicht die Kennzeichnung und Verfolgung kortikaler Astrozyten, von embryonalen bis spät postnatalen Stadien, unabhängig von GFAP-Expression^14,23. Jedes dieser Transgene trägt die folgenden vier unterschiedlichen FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP und tdTomato/mCherry, die minimale spektrale Überlappung anzeigen, die leicht mit 1) Sequential Channel Acquisition umgangen werden kann; 2) Optimierte Anregungsleistung und Sammelgewinn; und 3) Spezifische dichroitische Filter zur Erfassung schmaler FP-Emissionsfenster. Die MM-Strategie verwendet Cre/lox Rekombination mit einer selbstexzisierbaren Cre Recombinase (seCre), um den stochastischen Ausdruck von FP in einer zellulären Population zu fördern. Eine einzige Kopie des MM-Transgens drückt FP auf sich gegenseitig ausschließende Weise aus, während mehrere Transgene FP-Kombinationen hervorrufen und Dutzende von unterschiedlichen Farbtönen erzeugen. Die genomische Integration der Transgene wird durch das PiggyBac (PB) oder Tol2 Transposition System^24,25,26angetrieben. Daher ermöglichen das MM-Toolkit und das von ihm erzeugte mehrfarbige “Mosaik” durch die Utero-Elektroporation die gleichzeitige Markierung mehrerer benachbarter kortikaler Vorläufer und die Verfolgung ihres gliakalen Abstiegs, einschließlich kortikaler Astrozyten, über lange Zeiträume. Farbkontraste, die sich aus der Expression einer deutlichen FP-Abgrenzung der Kontur von PrA ergeben, und extrahieren anschließend wichtige Informationen über ihr territoriales Volumen (mit IMARIS) und komplexe Morphologie (mit Vaa3D). Die hier vorgestellte Multicolor-Strategie ist eine praktische und robuste Methode, die einen schnellen und einfachen Zugriff auf die kortikale Astrozytenoberfläche und Morphologie bei Wildtypmäusen in verschiedenen Entwicklungsstadien ermöglicht und leicht anpassungsfähig ist, um astrozyte anatomische Merkmale in Mausmodellen neurologischer Erkrankungen zu untersuchen, ohne transgene Reporterlinien zu verwenden.