Électroporation in Utero de marqueurs multiaddressables intégrant la couleur du génome (MAGIC) pour individualiser les astrocytes corticals de souris

Les astrocytes jouent de nombreuses fonctions vitales dans le développement du cerveau et la^{physiologie 1}. Outre leur rôle à la barrière hémono-encéphalique où ils régulent l’absorption des nutriments et le flux sanguin, ils contribuent activement à la formation et à la fonction de la synapse tout en produisant des neuromodulateurs qui peuvent modifier l’activité neuronale et le^{comportement 2}. En outre, le dysfonctionnement d’astrocyte contribue à une série de désordres neurologiques^3. Les astrocytes situés dans le cortex cérébral présentent une morphologie élaborée permettant un contact étendu avec les processus neuronaux. Ces contacts, essentiels à la fonction du circuit, contrôlent également la morphogenèse et la synaptogenèse des astrocytes par le biais de protéines d’adhérence^{cellulaire 4}. Les neuroscientifiques ont besoin d’outils pratiques et robustes pour étudier le développement des astrocytes et la morphogenèse dans leurs modèles neurologiques d’intérêt. Cependant, en raison de l’apposition étroite des astrocytes à leurs voisins et de leur carrelage tridimensionnel uniforme, il est difficile d’étiquetant les astrocytes corticaux et d’évaluer globalement leur morphologie à l’aide d’immunomarqueurs.

Actuellement, deux stratégies principales de génie génétique permettent l’étiquetage et l’individualisation des astrocytes corticals in situ : l’activation clairsemée de journaliste dans les lignes transgéniques de souris ou la transgenèse somatique utilisant l’électroporation des plasmides de journaliste. La première stratégie repose sur l’élevage d’une ligne de souris reporter floxed avec des souris exprimant une forme inductible de Cre recombinase activé spécifiquement dans les astrocytes lors de la livraison de tamoxifène (par exemple, Aldh1l1-CreERT2⁵). Plusieurs inconvénients sont associés à cette stratégie. Tout d’abord, la reproduction de souris transgéniques nécessite un grand nombre d’animaux et de multiples analyses sont généralement nécessaires pour déterminer la bonne dose de tamoxifène pour fournir une étiquetage suffisamment clairsemée des astrocytes corticals. L’analyse des phénotypes corticals d’astrocyte dans un modèle génétique de souris d’intérêt exigera encore plus d’élevage et de consommation de souris. En outre, l’injection in utero tamoxifène est connue pour interférer avec la parturition, ce qui rend cette stratégie difficile à appliquer à l’étude des premiers stades du développement des astrocytes. L’électroporation in vivo de l’ADN est une stratégie alternative sans tamoxifène qui repose sur un nombre minimum d’animaux⁶. Réalisée à des stades embryonnaires ou postnatals, cette approche consiste à injecter des plasmides reporter dans les ventricules latéraux des rongeurs suivis d’impulsions électriques qui créent des pores dans la membrane cellulaire, permettant ainsi à l’ADN d’entrer dans les cellules progénitrices tapissant le ventricule. Par la suite, les transgènes reporter transportés par les plasmides électroporés sont traités par les machines cellulaires ciblées et^{exprimés 7}. Deux méthodes d’électroporation ont été précédemment décrites pour étiqueter les astrocytes corticals de souris : 1) étiquetage postnatal d’astrocyte par électroporation (PALE), qui s’appuie sur l’électroporation des plasmides épisomal monocolores de reporter de 1-2 aux étapes postnatales^{tôt 4}; 2) La stratégie StarTrack basée sur l’électroporation in utero (IUE) de plusieurs plasmides reporter intégrateur monocolore^8,9,10. Bien que ces deux techniques étiquettent efficacement la PrA dans le cortex cérébral, elles présentent également certaines limitations. Dans leur version initiale, les deux méthodes s’appuient sur un promoteur glial de protéine acide fibrillaire (GFAP) pour conduire l’expression dans les astrocytes, qui peuvent biaiser l’étiquetage vers les gliales radiales aussi bien que les astrocytes piaux et réactifs qui expriment GFAP plus fortement que pra de repos normal^11,12. En ce qui concerne pale, d’autres inconvénients sont le stade tardif de l’électroporation, qui empêche l’étiquetage de prA tôt-né (ou ceux provenant des progéniteurs délaminating tôt) et l’analyse des premiers stades du développement d’astroglia, et l’utilisation des vecteurs épisomal qui deviennent dilués par des divisions successives pendant la prolifération massive que PrA subissent pendant la première semaine postnatale^13,14. Contrairement à PALE, StarTrack est basé sur l’électroporation embryonnaire des plasmides de reporter intégratifs qui permettent de suivre la contribution des progéniteurs embryonnaires et postnatals à la PrA. Un système StarTrack mis à jour en s’appuyant sur le promoteur ubiquitine C (UbC-StarTrack) réalise une expression plus large des reporters fluorescents dans la descente neuronale et gliaë (astrocytes inclus) des progéniteurs neuronaux^15,16,17. Toutefois, dans sa version actuelle, la mise en œuvre de cette approche est complexe, car elle repose sur un mélange équimolaire de 12 plasmides distincts exprimant six protéines fluorescentes (FP) avec excitation partielle et chevauchement des spectres d’émission.

Présenté ici est une simple méthode d’étiquetage multicolore à base d’électroporation utero en utilisant des constructions de journaliste intégrateur conduit par un promoteur fort et largement actif pour étiqueter les astrocytes corticals¹⁴. En outre, un pipeline facile d’analyse d’image utilisant des logiciels d’analyse d’image sous licence (p. ex., Imaris) et en libre accès (Vaa3D^18,19,20)est fourni pour segmenter le volume territorial et l’arborisation des astrocytes, respectivement. Par rapport aux méthodes décrites précédemment, cette stratégie repose uniquement sur 1-2 transgènes intégratifs multicolores Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers ou MM²¹) dirigés vers le compartiment cytoplasmique et (en option) des cellules nucléaires dont l’expression est pilotée par un promoteur synthétique du CAG composé d’un exhausteur de cytomégalovirus, d’un promoteur de β-actine de poulet et d’un site d’accepteur d’épissage de β-globine^{de lapin 22}. Cela permet l’étiquetage et le suivi des astrocytes corticals, des stades postnatals embryonnaires aux stades postnatals tardifs, indépendamment de l’expression^{GFAP 14,23}. Chacun de ces transgènes porte les quatre FP distincts suivants : eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP et tdTomato/mCherry, qui présentent un chevauchement spectral minimal qui peut être facilement contourné avec 1) l’acquisition séquentielle de canaux; 2) Puissance d’excitation optimisée et gain de collection ; et 3) Filtres dichroïques spécifiques pour recueillir les fenêtres d’émission fp étroites. La stratégie MM utilise la recombinaisonCre/lox avec une recombinase cre auto-excisable (seCre) pour stimuler l’expression stochastique de fp dans une population cellulaire. Une seule copie de MM transgene exprime FP d’une manière mutuellement exclusive, tandis que plusieurs transgènes donnent lieu à des combinaisons FP, créant des dizaines de teintes distinctes. L’intégration génomique des transgènes est entraînée par le système de transposition piggyBac (PB) ou Tol2^24,25,26. Par conséquent, grâce à l’électroporation in utero, la boîte à outils MM et la « mosaïque » multicolore qu’elle génère permettent le marquage simultané de plusieurs progéniteurs corticals adjacents et le suivi de leur descente gliale, y compris les astrocytes corticals, sur de longues périodes. Les contrastes de couleurs résultant de l’expression d’un FP distinct permettent de délimiter le contour de la PrA et d’extraire par la suite des informations clés sur leur volume territorial (à l’aide de l’IMARIS) et leur morphologie complexe (à l’aide de Vaa3D). La stratégie multicolore présentée en détail ici est une méthode pratique et robuste qui donne un accès rapide et facile à la surface corticale des astrocytes et à la morphologie chez les souris de type sauvage à différents stades de développement, et est facilement adaptable pour étudier les caractéristiques anatomiques des astrocytes dans les modèles muraux de maladies neurologiques sans utiliser de lignes de reporter transgéniques.