إعداد شرائح فرس النهر البشري الحادة للتسجيلات الكهربية
Summary
ويصف البروتوكول المقدم نقل وإعداد أنسجة فرس النهر البشرية التي تم استئصالها بهدف نهائي هو استخدام شرائح الدماغ الحيوية كأداة تقييم قبل الظهر للمواد المضادة للصرع المحتملة.
Abstract
ويصيب الصرع حوالي 1% من سكان العالم ويؤدي إلى انخفاض حاد في نوعية الحياة بسبب النوبات المستمرة وكذلك ارتفاع خطر الوفاة المفاجئة. على الرغم من وفرة من خيارات العلاج المتاحة، حوالي 30٪ من المرضى مقاومة للأدوية. وقد تم تطوير العديد من العلاجات الجديدة باستخدام نماذج حيوانية، على الرغم من أن معدل المرضى المقاومين للأدوية لا يزال دون تغيير. أحد الأسباب المحتملة هو عدم وجود ترجمة بين نماذج القوارض والبشر ، مثل ضعف تمثيل المقاومة الدوائية البشرية في النماذج الحيوانية. أنسجة الدماغ البشرية المُجَرَّدة كأداة تقييم قبل الإكلينيكية لديها ميزة سد هذه الفجوة الترجمية. هو موضح هنا هو وسيلة لإعداد عالية الجودة لشرائح الدماغ فرس النهر الإنسان والحث مستقرة لاحقة من نشاط الصرع. البروتوكول يصف تحريض نشاط انفجار أثناء تطبيق 8 م م KCl و 4-aminopyridin. هذا النشاط حساس لاكوساميد AED المنشأة أو المرشحين رواية لمكافحة البيبيل، مثل dimethylethanolamine (DMEA). بالإضافة إلى ذلك, الأسلوب يصف التعريفي من الأحداث مثل المضبوطات في CA1 من شرائح الدماغ فرس النهر الإنسان عن طريق الحد من خارج الخلية ملغ2 + وتطبيق bicuculline, مانع مستقبلات GABAA. يمكن استخدام الإعداد التجريبي لفحص المواد المضادة للصرع المحتملة لآثارها على نشاط الصرع. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقق من صحة آليات العمل التي تُفترض بشأن مركبات معينة باستخدام هذا النهج في الأنسجة البشرية (على سبيل المثال، استخدام تسجيلات التحامل). في الختام، فإن التحقيق في الأنسجة الحيوية في الدماغ البشري السابقين في الدماغ (هنا، الحصين المُجَرَّح من المرضى الذين يعانون من صرع الفص الصدغي) سيحسن المعرفة الحالية للآليات الفسيولوجية والمرضية في الدماغ البشري.
Introduction
الصرع هو واحد من الاضطرابات العصبية الأكثر شيوعا، التي تؤثر على 1٪ من سكان العالم، ويرتبط مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات1،2. للأسف، ثلث المرضى الذين يعانون من الصرع مقاومة للأدوية، على الرغم من وفرة من خيارات العلاج المتاحة بما في ذلك أكثر من 20 الأدوية المضادة للصرع المعتمدة (AEDs)3. الفشل في ترجمة النتائج من البحوث الحيوانية قبل السريرية إلى التجارب السريرية هو أحد الأسباب التي تجعل استراتيجيات العلاج الواعدة ليست فعالة في العديد من المرضى4. في الآونة الأخيرة, وقد ثبت neuropeptide Y (NPY) و galanin أن يكون لها آثار مكافحة البُلَد في النماذج الحيوانية; على الرغم من, عندما اختبارها في أنسجة الدماغ البشري مُجَذَّب, فقط كان NPY فعالة5.
21- ومعظم المعارف القائمة المتعلقة بالآليات العصبية الأساسية ومناهج العلاج بالأمراض تنبع من نماذج حيوانية وتجارب استزراع الخلايا. على الرغم من أن المعلومات، وهذه النماذج تمثل جوانب واحدة فقط من الأمراض البشرية المعقدة وشبكة الدماغ البشري الكبار. بدلا من ذلك، أنسجة الدماغ البشرية لديها القدرة على سد الفجوة الترجمية ولكن نادرا ما تكون متاحة للدراسات الوظيفية. على سبيل المثال، أنسجة الدماغ بعد الوفاة كانت أداة قيمة في التحقيق في التعبير البروتيني، مورفولوجيا الدماغ، أو الاتصالات التشريحية، على الرغم من أن نشاط الخلايا العصبية غالبا ما يتعرض للخطر هو هذا النسيج6،,7،,8،,9،,10،,11.
في المقابل، تم التحقيق في الأنسجة المخية البشرية الحية المُجَرَّحَة فيما يتعلق بتقييم الأدوية قبل الكلينيكية، وظائف الخلايا العصبية الأساسية وأنماط التعبير الجيني12،13،14،15،16،17. ميزة كبيرة من شرائح الدماغ البشري مقارنة مع شرائح القوارض هو جدوى طويلة من الأنسجة العصبية بعد استئصال وإعداد. بالمقارنة مع شرائح الدماغ القوارض، والتي يمكن عادة أن تسجل لمدة تصل إلى 8 ساعة بعد إعداد، شرائح الدماغ البشري تظهر نشاط الخلايا العصبية مستقرة لمدة تصل إلى 72 ساعة، مما يتيح إجراء تحقيق شامل لهذه العينات النادرة وقيمة12،18.
وقد بحثت العديد من الدراسات خصائص نشاط الصرع في مناطق مختلفة من الأنسجة القشرية وهرون الدماغ الإنسان استئصالها واستخدمت أساليب مختلفة لالتحث على نشاط الصرع. في شرائح القوارض، يمكن أن يسبب نشاط الصرع عدة طرق: التحفيز الكهربائي لخلايا DG hilar، زيادة K+ خارج الخلية (8-12 mM KCl)، حظر مستقبلات GABAA بواسطة bicuculline (BIC)، منع قنوات البوتاسيوم من قبل 4-أمينوبيريدين (4-AP)، وإزالة أو تقليل Mg2+ في محلول خارج الخلية19. ومع ذلك ، فإن تحريض نشاط الصرع في الأنسجة البشرية يتطلب الجمع بين اثنين على الأقل من الطرق المذكورة أعلاه20،21،22.
هنا هو طريقة لإعداد شرائح الدماغ فرس النهر الإنسان, التي هي قابلة للحياة لمدة تصل إلى 20 ح وإظهار تحريض النشاط الصرع عند تطبيق عالية K+ (8 mM) و 4-AP أو منخفضة ملغ2 + و BIC.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن نسيج الدماغ البشري الذي يُعاد استئصاله هو أداة قيمة للغاية في التقييم قبل الكلينيكي لـ AEDs ، لأنه يمثل بشكل صحيح شبكة صغيرة للدماغ البشري سليمة. يصف البروتوكول المعروض طريقة لنقل الأنسجة وإعدادها، والتي تضمن شرائح فرس النهر عالية الجودة بالإضافة إلى طريقة تحريضية مستقرة لنشاط الصرع الحاسم لتقييم AED.
وقد سبق أن أظهرت التحقيق في نشاط الصرع وكذلك طرق الحث الكيميائية أو الكهربائية في شرائح الدماغ البشري من قبل مجموعات أخرى17,20,21,22. يصف هذا البروتوكول تحريض نشاط الاندفاع المستقر في شرائح من المرضى المختلفين عن طريق تطبيق K++4-AP العالي وكذلك تحريض SLEs في منطقة CA1 عن طريق تطبيق من انخفاض Mg2 +BIC. ووجد أن تحريض نشاط الاندفاع أكثر اتساقا (80٪ من شرائح اختبارها في 15 مريضا) من تحريض SLEs (50٪ من شرائح اختبارها في مريض واحد). ومع ذلك ، حتى الآن ، تم اختبار تحريض SLEs فقط في مريض واحد. ومع ذلك, ويوصى التعريفي من SLEs من قبل منخفضة Mg2 ++ BIC, كما SLEs لم تكن قادرة حتى الآن على أن تكون مستحثة باستخدام K عالية++4-AP.
وقد أدخلت العديد من الدراسات أساليب لنقل وإعداد أنسجة الدماغ البشري وغالبا ما تسلط الضوء على ثلاثة عوامل حاسمة لبقاء الخلايا العصبية: وقت النقل، وحلول النقل المستخدمة، وظروف التخزين.
للحصول على القدرة على البقاء على النحو الأمثل شريحة, بعض المجموعات تشير إلى أن نقل أنسجة الدماغ مُجَرَّح تكون قصيرة قدر الإمكان. ومع ذلك، نادراً ما تكون غرف العمليات والمختبرات على مقربة، مما يعني أن جودة الشريحة قد تتعرض للخطر بسبب وسائل النقل الطويلة. وقد تغلبت بعض المجموعات على هذه العقبة بتطبيق ثابت O2 على الحل أثناء النقل12. لقد نقلنا أنسجة المخ لفترة قصيرة (الحد الأقصى = 15 دقيقة) وطويلة (تصل إلى 1 ساعة) فترات من الزمن دون ثابت إضافية O2 العرض أثناء النقل، على غرار مجموعات أخرى18،,25. في هذه الحالات، لم تلاحظ الاختلافات في جودة الأنسجة أثناء التسجيلات الصرعية. في التواصل مع مجموعات أخرى في معهدنا ، لم تتغير جودة الشريحة للتجارب المشبك ، سواء. في المقابل، التباين في نوعية الأنسجة ينبع ربما من الضرر أثناء العمليات، والتشريح لفترات طويلة، و تشريح الإجراء.
فيما يتعلق النقل وقطع الحل، وجميع الأساليب المنشورة حذف NaCl من الحلول للحد من تورم الخلايا بسبب الضغط التناضحي، على غرار الإجراء القياسي لتجارب القوارض التصحيح المشبك. ومع ذلك، فقد تم إدخال العديد من البدائل حتى الآن (أي السكروز القائم على aCSF13،22، NMDG القائم على aCSF12،26، والكولين القائم على aCSF27). قدم تينغ وزملاؤه aCSF القائم على NMDG لإعداد شريحة في 201426 وأضاف في وقت لاحق بروتوكول الانتعاش، الذي يعيد ببطء NaCl إلى شرائح28. ومع ذلك، كما وصفها Ting وآخرون، الخلايا العصبية من أنسجة الدماغ أعدت في ACSF المستندة إلى NMDG إظهار مقاومة الغشاء أعلى، مما يؤثر على ختم الخلية الكاملة خلال التجارب التصحيح المشبك26. ولذلك, لقد انتقلنا من NMDG القائم على aCSF إلى استخدام aCSF20القائم على الكولين , الذي ينتج شرائح عالية الجودة لكل من إمكانات الحقل والتسجيلات المشبك التصحيح.
فيما يتعلق بتخزين شرائح، فمن المسلم به عموما أن ظروف واجهة توفير الأوكسجين الأمثل حاسمة لشريحة طويلة البقاء على قيد الحياة18. ومع ذلك، تظهر مجموعات أخرى شريحة البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 72 ساعة تحت ظروف مغمورة12. على عكس الفرضية السابقة ، يبدو أن شرائح الدماغ البشرية أكثر مقاومة لانخفاض الأكسجين أو الإجهاد التأكسي مقارنة بشرائح القوارض. في المقام الأول، تم استخدام غرف الواجهة سابقًا لتخزين شرائح فرس النهر البشرية، على الرغم من أنه يوصى بالظروف المغمورة للحفاظ على شرائح الدماغ البشرية في تجارب المشبك.
كما ناقشته مجموعات أخرى، خطوة إضافية حاسمة للبقاء على قيد الحياة شريحة طويلة (واجهة ل<48 ح18،المغمورة ل< 72 ح12) هو منع التلوث البكتيري. وعادة ما تستخدم شرائح الدماغ القوارض في التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية لمدة تصل إلى 8 ساعات، والتلوث البكتيري لا يعتبر يؤثر على صلاحية شريحة خلال هذه الفترة. ويبرز العدد الكبير من الشرائح المعدة من استئصال واحد والتوافر غير المألوف لأنسجة الدماغ البشري الحاجة إلى إطالة أمد صلاحية شرائح الدماغ البشري. هذه الطريقة تصف بنجاح إعداد الحية الإنسان شرائح الدماغ قرن آمون، والتي يمكن بسهولة تكييفها لظروف معقمة. ومع ذلك ، للتسجيلات التي أجريت هنا ، فإن بقاء الشريحة الممتد 20 ساعة لم يكن أولوية.
كما تبين أن التسجيل في غرف الواجهة ضروري لاستقراء نشاط الصرع مثل SLEs22. نادرا ما تستخدم الظروف المغمورة، بسبب انخفاض الأوكسجين، لتسجيل SLEs. على الرغم من ذلك، فهي ضرورية للدقة الضوئية عالية اللازمة للتجارب التصحيح المشبك. استخدام غرفة تسجيل نوع مغمورة الأمثل تمكن من تسجيل نشاط الصرع (خارج الخلية مجال أو خلية عصبية واحدة) في شرائح الدماغ البشري، وذلك بسبب ارتفاع الأوكسجين وتطبيق المخدراتالسريعة 29. هنا، يتم وصف أساليب ونتائج التسجيلات المحتملة الميدانية، ولكن ينبغي التأكيد على أن تسجيلات اللصقات تم تنفيذها بنجاح في شرائح الماوس والدماغ البشري باستخدام هذه الغرفة التسجيل المعدلة (البيانات غير مبينة).
أنسجة الدماغ البشرية المُجَرَّح لها قيمة تحويلية أعلى مقارنةً بنماذج القوارض. وهو يمثل الكبار, شبكة الخلايا العصبية المريضة التي لا يمكن استنساخها من قبل iPSCs. ومع ذلك ، كما هو الحال في أي نظام في المختبر ، شرائح الدماغ البشري لا تمثل الدماغ البشري سليمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تخضع الشبكات العصبية المسجلة من أنسجة الدماغ المُجَرَّحَة لتغييرات جزيئية ووظيفية كبيرة بسبب التلف أثناء التشغيل أو الإعداد. وقد تبين أن إجراءات تشريح تؤثر على وظيفة GABAergic وقد تؤثر على تحريض النشاط الصرع30. وينبغي النظر في هذه القيود عند صياغة فرضية. عند اختبار الأدوية المضادة للصرع المحتملة ، ينبغي النظر في استخدام مناطق مختلفة من الدماغ ، حيث قد لا يتم التعبير عن أهداف المخدرات في جميع مناطق الدماغ البشري أو جميع المرضى. على وجه الخصوص، وفرس النهر من المرضى TLE غالبا ما تظهر علامات التصلب قرن آمون يرافقه فقدان الخلايا العصبية الشديدة. من المستحسن الحصول على معلومات المريض عن التغيرات المرضية وتاريخ المرض ، مثل الانكسار المحتمل تجاه الأدوية ، والنظر في ذلك أثناء تفسير البيانات.
في الختام، هذه الطريقة تصف بنجاح إعداد الحية الإنسان شرائح الدماغ قرن آمون وتقنيات الحث لتسجيل نوعين مختلفين من نشاط الصرع. وبما أن توافر أنسجة الدماغ البشرية الحية أمر نادر الحدوث، ينبغي استخدام ظروف النقل والتسجيل المثلى لضمان أقصى قدر من الناتج من التجارب باستخدام شرائح الدماغ البشري. ويقترح أن أنسجة الدماغ البشرية التي تم استئصالها يمكن استخدامها كأداة للتحقق قبل التثبت من صحة القوارض وتجارب زراعة الخلايا.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ماندي ماربلر-بوتر (Charite-Unversitätsmedizin، برلين) على المساعدة التقنية الممتازة. تم تمويل P.F. من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG، دويتشه Forschungsgemeinschaft) في إطار استراتيجية التميز في ألمانيا-EXC-2049-390688087. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مركز كويست لتحويل البحوث الطبية الحيوية في معهد برلين للصحة.
Materials
| (+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
| Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
| CaCl2 | Merck | 102382 | |
| Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
| Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
| Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
| Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
| Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
| KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
| Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
| Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
| MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
| Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referenzen
- Hirtz, D., et al. How common are the “common” neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
- Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
- Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
- Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
- Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
- Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
- Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
- Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
- Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407 (2018).
- Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
- Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based “release on demand” gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963 (2019).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
- Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30 (2015).
- Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
- Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209 (2019).
- Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
- Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
- Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818 (2016).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, 221-242 (2014).
- Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12 (2010).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519 (2016).
- Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).
