Este método de especiación redox de hierro se basa en la espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente por electroforesis capilar con apilamiento de muestras combinada con análisis cortos en una sola ejecución. El método analiza rápidamente y proporciona bajos límites de cuantificación para las especies de redox de hierro en una amplia gama de tejidos y muestras de biofluidos.
La disosostasis del metabolismo del hierro se cuenta en el marco fisiopatológico de numerosas enfermedades, incluyendo el cáncer y varias condiciones neurodegenerativas. El hierro excesivo produce Fe(II) libre de redox-activo y puede causar efectos devastadores dentro de la célula como el estrés oxidativo (OS) y la muerte por peroxidación lipídica conocida como ferroptosis (FPT). Por lo tanto, las mediciones cuantitativas del hierro ferroso (Fe(II)) y férrico (Fe(III)) en lugar de la total de la fe-determinación son la clave para una visión más detallada de estos procesos perjudiciales. Dado que las determinaciones de Fe(II)/(III) pueden verse obstaculizadas por cambios rápidos en estado redox y bajas concentraciones en muestras relevantes, como el líquido cefalorraquídeo (LCR), deben estar disponibles métodos que analicen rápidamente y proporcionen bajos límites de cuantificación (LOQ). La electroforesis capilar (CE) ofrece la ventaja de la separación rápida Fe(II)/Fe(III) y funciona sin una fase estacionaria, lo que podría interferir con el equilibrio redox o causar adherencia de analito. CE combinado con espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente (ICP-MS) como detector ofrece una mejora adicional de la sensibilidad de detección y la selectividad. El método presentado utiliza 20 mM HCl como electrolito de fondo y una tensión de +25 kV. Las formas de pico y los límites de detección de concentración se mejoran mediante el apilamiento por conductividad pH. Para la reducción de 56[ArO]+, ICP-MS fue operado en el modo de célula de reacción dinámica (DRC) con NH3 como gas de reacción. El método logra un límite de detección (LOD) de 3 g/L. Debido al apilamiento, los volúmenes de inyección más altos fueron posibles sin obstaculizar la separación, pero mejorando el LOD. Las calibraciones relacionadas con el área de pico fueron lineales de hasta 150 g/L. La precisión de la medición fue del 2,2% (Fe(III)) a 3,5% (Fe(II)). La precisión del tiempo de migración fue de <3% para ambas especies, determinada en 1:2 lysatos diluidos de células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y). Los experimentos de recuperación con adición estándar revelaron precisión de 97% Fe(III) y 105 % Fe(II). En las bio-muestras de la vida real como el CSF, el tiempo de migración puede variar según la conductividad variable (es decir, la salinidad). Por lo tanto, la identificación de picos se confirma mediante la adición estándar.
Hoy en día, es más evidente que el estrés oxidativo mediado por hierro (OS) juega un papel crucial en múltiples trastornos específicamente en trastornos cerebrales neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer y Parkinson, así como en el cáncer1,2,3,4. El sistema operativo está estrechamente relacionado con el estado y el equilibrio de la redox-pareja Fe(II)/Fe(III). Mientras que Fe(III) es redox-inactivo, Fe(II) genera poderosamente especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante la catalización de H2O2 de descomposición seguida de la producción de radicales hidroxilo y la peroxidación lipídica de membrana5,6. A nivel molecular, ROS generados por Fe(II) y fosfolípidos peroxidizados son un fuerte ataque a la integridad de proteínas, lípidos y ADN7,,8. Se demostró que tal disfunción celular perjudicial induce disfunción mitocondrial con disminución del contenido de ATP9 e incluso puede desencadenar una muerte celular necrótica programada, conocida como ferroptosis (FPT)10,,11. Por lo tanto, la especiación cuantitativa de redox Fe(II)/(III) es de importancia eminente en un amplio espectro de trastornos relacionados con redox.
La especiación química es una herramienta bien establecida para el estudio de oligoelementos de papel biológico y metabolismo en general7,,8 así como en condiciones neurodegenerativas12,,13,14,15,16,17. Los métodos para la especiación Fe-redox que se encuentran en la literatura se basan típicamente en la separación de cromatografía líquida (LC). Parte de la literatura utiliza espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente (ICP-MS) como detector selectivo de elementos. Sin embargo, en el trabajo de rutina LC, se necesitaban tiempos de purga excesivos entre las corridas. La variación de lote a lote aún más problemática de las columnas LC obligó a la reo optimization de las condiciones de elución después de cada cambio de columna. Estos problemas están obstaculizando el alto rendimiento. Se requiere tiempo adicional para obtener una fiabilidad aceptable y evaluar minuciosamente el método de nuevo.
Para eludir estos inconvenientes, aquí se presenta un método para la espectrometría redox Fe(II)/Fe(III) basada en la espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente por electroforesis capilar (CE-ICP-MS). CE ofrece varias ventajas en comparación con LC18. Los capilares no tienen fase estacionaria y, por lo tanto, no dependen (casi) de la identidad del lote. Cuando se envejecen o se bloquean, se reemplazan rápidamente, mostrando un rendimiento generalmente sin cambios. Los pasos de purga y limpieza entre las muestras son efectivos y cortos, y el tiempo de análisis por muestra también es corto.
El método presentado es fiable con buenas cifras de mérito. Como prueba de principio, el método se aplica al lisato celular del neuroblastoma dopaminérgico humano (SH-SY5Y), un tipo de muestra importante en la neurodegeneración, así como la investigación del cáncer19.
Dado que el hierro desempeña un papel destacado en la progresión del sistema operativo, facilitando así la disfunción mitocondrial o FTP, en este artículo se presenta un método cuantitativo versátil basado en CE-ICP-MS para la especiación simultánea Fe(II)/Fe(III) y su aplicación se demuestra ejemplarmente en los linsatos celulares. El método proporcionó un breve tiempo de análisis y las cifras de mérito (LOQ, precisión, recuperación) son adecuados para muestras relevantes para la especiación de redox de hierro específicamente en la investigación neurodegenerativa y el cáncer. En comparación con los métodos anteriores basados en LC, este método basado en CE es prácticamente independiente de los lotes de columnas y los problemas de reproducibilidad observados anteriormente después del cambio de columna LC. La preparación capilar antes de cada carrera es de <4 minutos y el tiempo de análisis por muestra con salinidad moderada hasta 3 min. Aparte de la carga y el tamaño de las moléculas, el tiempo de migración en CZE depende de la conductividad en el tapón de la muestra, lo que provoca variaciones o cambios en el tiempo de migración cuando las propias muestras influyen considerablemente en la conductividad. Tales cambios en el tiempo de migración son bien conocidos en la electroforesis capilar. Este es un problema inmanente de CZE, conocido de la literatura21,22. Las normas y los licatos celulares SH-SY5Y tenían una conductividad moderada y homogénea. En consecuencia, los tiempos de migración mostraron pocos cambios con buena precisión. Sin embargo, para muestras con alta conductividad, se pueden observar tiempos de migración prolongados hasta 5 min. Por lo tanto, se recomiendan adiciones estándar para la identificación clara de especies.
Un problema crítico en la especiación de redox de hierro es la estabilidad de la especie (es decir, el mantenimiento de los equilibrios Fe(II)/(III) durante la preparación de la muestra8,13. El pH inapropiado o los productos químicos quelantes, así como las condiciones de almacenamiento inadecuadas, como el oxígeno (aire) en contacto con la muestra o una rotura en el almacenamiento congelado en profundidad, pueden cambiar fácilmente el equilibrio Fe(II)/(III). Por lo tanto, para la preparación de los lissatos celulares SH-SY5Y, se eligió un tampón de lysis sin ningún producto químico quelante, pH fisiológico, pero se aplicó una recubrimiento de gas inerte durante la preparación de la muestra, en recipientes de muestra y congelación profunda inmediata para estas muestras.
En la literatura, se pueden encontrar enfoques semicuantitativos para monitorear Fe(II). Para una mejor comprensión del papel del hierro en el estrés oxidativo, varios grupos de investigación desarrollaron sondas específicas de Fe(II) para monitorear y visualizar semicuantitativamente la elevación aberrante del hierro ferroso in vitro. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estas sondas no consideran Fe(III) y no cuantifican sino que informan sólo “más” o “menos” Fe(II)). Hasta la fecha, sólo unos pocos biomarcadores están disponibles para determinar el sistema operativo y el FPT, debido a la falta de métodos fiables para cuantificar simultáneamente las especies de redox Fe(II)/Fe(III)23,,24. Teniendo esto en cuenta, el método presentado -facilitando la cuantificación rápida de ambos, Fe(III) y Fe(II) en una sola ejecución – puede convertirse en una herramienta prometedora para profundizar la visión de los procesos moleculares dependientes del hierro.
The authors have nothing to disclose.
VV fue apoyado por la beca de investigación intramuros (Forschungsf-rderung) del Centro Médico Universitario de Gotinga y el programa de investigación Else Kr’ner del Else Kr’ner-Fresenius-Stiftung.
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |