Этот метод видообразования редокса железа основан на капиллярной электрофорез-индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрии с укладкой образца в сочетании с коротким анализом за один запуск. Метод быстро анализирует и обеспечивает низкие пределы количественной оценки для видов красного железа в различных тканях и биофлюидных образцах.
Дисгеостаз метаболизма железа учитывается в патофизиологических рамках многочисленных заболеваний, в том числе онкологических и нескольких нейродегенеративных состояний. Чрезмерное железо приводит к свободному редокс-активному Fe (II) и может вызвать разрушительные последствия в клетке, такие как окислительный стресс (ОС) и смерть от перекисного окисления липидов, известного как ферроптоз (FPT). Таким образом, количественные измерения железа ферроса (Fe(II)) и железа феррика (Fe(III)) вместо полного определения Fe является ключом к более внимательному пониманию этих пагубных процессов. Поскольку определения Fe (II)/(III) могут быть затруднены быстрыми сдвигами редокс-состояния и низкими концентрациями в соответствующих образцах, таких как спинномозговая жидкость (CSF), должны быть доступны методы, которые быстро анализируют и обеспечивают низкие пределы количественной оценки (ЛОЗ). Капиллярный электрофорез (CE) предлагает преимущество быстрого разделения Fe (II)/Fe(III) и работает без стационарной фазы, которая может помешать балансу редокса или вызвать прилипание аналита. CE в сочетании с индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрией (ICP-MS) в качестве детектора предлагает дальнейшее улучшение чувствительности и избирательности обнаружения. Представленный метод использует 20 мМВ HCl в качестве фонового электролита и напряжения 25 кВ. Пиковые формы и пределы обнаружения концентрации улучшаются путем укладки проводимости рН. Для уменьшения на 56«ArO» ICP-MS работал в режиме динамической реакционной ячейки (ДРК) с NH+3 в качестве реакционной реакции газа. Метод достигает предела обнаружения (LOD) в 3 мкг/л. Благодаря укладке, более высокие объемы инъекций были возможны без затруднения разделения, но улучшения LOD. Калибровки, связанные с пиковой областью, были линейными до 150 мкг/л. Точность измерений составила 2,2% (Fe(III)) до 3,5% (Fe(II)). Точность времени миграции составила lt;3% для обоих видов, определяемых в 1:2 разбавленных лизатах клеток нейробластомы человека (SH-SY5Y). Эксперименты по восстановлению со стандартным добавлением показали точность 97% Fe (III) и 105% Fe (II). В реальных био-образцах, таких как CSF, время миграции может варьироваться в зависимости от различной проводимости (т.е. солености). Таким образом, пик идентификации подтверждается стандартным добавлением.
Сегодня наиболее очевидно, что железо-опосредованное окислительное напряжение (ОС) играет решающую роль в многочисленныхрасстройств,в частности, в нейродегенеративных расстройств мозга, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, атакже в рак 1,2,3,4. ОС тесно связана с состоянием и балансом редокс-пары Fe (II)/Fe (III). В то время как Fe (III) является redox-неактивным, Fe (II) мощно генерирует реактивный вид кислорода (ROS) путем катализации H2O2 разложения следуют из гидроксилового радикала производства и мембраны перекисногоокисления липидов 5,6. На молекулярном уровне, Fe (II)-генерируемых ROS и пероксидированных фосфолипидов являются сильным нападением на целостность белков, липидов иДНК 7,8. Такая вредопроизвольная клеточная дисфункция была продемонстрирована, чтобы вызвать митохондриальнуюдисфункцию с уменьшенным содержанием АТФ 9 и может даже вызвать запрограммированную смерть некротических клеток, известный какферроптоз(FPT) 10,11. Таким образом, количественное Фе (II)/(III) видообразование редокса имеет большое значение в широком спектре расстройств, связанных с редоксом.
Химическая спецификация является устоявшимся инструментом для изучения микроэлементов биологическойроли и обмена веществ в целом 7,8, а также внейродегенеративных состояниях 12,,13,,14,,15,,16,,17., Методы видообразования Фе-редокса, найденные в литературе, как правило, основаны на разделении жидкой хроматографии (LC). Некоторые литературы используют индуктивно соединенную плазменную масс-спектрометрию (ICP-MS) в качестве элемента селективного детектора. Однако, в обычной работе LC, чрезмерное время чистки было необходимо между бегами. Еще более проблематичным является то, что пакетная вариация столбцов LC заставила пере оптимизацию условий elution после каждого изменения столбца. Эти проблемы препятствуют высокой пропускной способности. Требуется дополнительное время, чтобы получить приемлемую надежность и тщательно оценить метод еще раз.
Чтобы обойти эти недостатки, метод представлен здесь для Fe (II)/Fe (III) redox speciation на основе капиллярного электрофореза индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрии (CE-ICP-MS). CE предлагает различные преимущества по сравнению с LC18. Капилляры не имеют стационарной фазы и, таким образом, зависят (почти) не от личности партии. Когда они в возрасте или заблокированы, они быстро заменяются, показывая, как правило, неизменную производительность. Шаги очистки и очистки между образцами являются эффективными и короткими, и время анализа на выборку тоже короткое.
Представленный метод надежен с хорошими цифрами заслуг. В качестве доказательства принципа, метод применяется к человеку дофаминергической нейробластомы (SH-SY5Y) клеток ликат, образец типа важно в нейродегенерации, а также исследованиярака 19.
Так как железо играет заметную роль в прогрессировании ОС, тем самым облегчая митохондриальную дисфункцию или FTP, универсальный количественный метод на основе CE-ICP-MS для одновременного fe (II)/Fe (III) видообразования представлен в этой статье, и его применение образцово продемонстрировано в лизированиях клеток. Метод при условии короткого времени анализа и цифры заслуг (ЛОЗ, точность, восстановление) подходят для образцов, имеющих отношение к спецификации редокс железа конкретно в нейродегенеративных и онкологических исследований. По сравнению с предыдущими методами, основанными на LC, этот метод на основе CE практически не зависит от пакетов столбца и ранее наблюдались проблемы воспроизводимости после изменения LC-столбца. Капиллярная подготовка перед каждым запуском составляет 4 минуты и время анализа на образец с умеренной соленостью до 3 мин. Помимо заряда и размера молекулы, время миграции в СЗЕ зависит от проводимости в пробной пробке, что приводит к изменению времени миграции или сдвигам, когда сами образцы оказывают значительное влияние на проводимость. Такие сдвиги во времени миграции хорошо известны в капиллярных электрофорез. Это проблема, известная из литературы21,22. Стандарты и лизаты клеток SH-SY5Y имели умеренную и однородную проводимость. Следовательно, время миграции показало лишь небольшое изменение с хорошей точностью. Однако для образцов с высокой проводимостью продолжительное время миграции может наблюдаться до 5 минут. Поэтому для четкой идентификации видов рекомендуются стандартные дополнения.
Критическим вопросом в спецификации красного железа является стабильность видов (т.е. поддержание Fe (II)/(III) эквилибрии) во времяподготовки образца 8,13. Неуместные рН или хелатирующие химические вещества, а также ненадлежащие условия хранения, такие как кислород (воздух) при контакте с образцом или разрыв в глубоко замороженном хранилище, могут легко изменить баланс Fe (II)/(III). Поэтому для подготовки лизатов клеток SH-SY5Y для этих образцов был выбран лизизный буфер без каких-либо хелатирующих химических веществ, физиологических рН, но инертная накладка газа при подготовке образца, в пробных контейнерах и немедленной глубокой заморозке.
В литературе можно найти полуколиченые подходы к мониторингу Fe (II). Для улучшения понимания роли железа в окислительном стрессе несколько исследовательских групп разработали специальные зонды Fe(II) для полуколичественного мониторинга и визуализации аномальной высоты железа в пробирке. Однако, важно отметить, такие зонды не считают Fe (III) и не количественно, но доклад просто “больше” или “менее” Fe (II)). На сегодняшний день, только несколько биомаркеров доступны для определения ОС и FPT, будучи из-за отсутствия надежных методов для одновременной количественной оценки Fe (II)/Fe (III) redoxвидов 23,24. Имея это в виду, представленный метод – содействие быстрой количественной оценки как Fe (III) и Fe (II) в одном запуске – может стать перспективным инструментом для углубления понимания железозависимых молекулярных процессов.
The authors have nothing to disclose.
VV была поддержана интрамуральным исследовательским грантом (Forschungsf’rderung) Университетского медицинского центра Гёттингена и исследовательской программой Else Kr’ner-Fresenius-Stiftung.
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |