התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)

התראה: השיטה משתמשת בחומצה הידרוכלורית (HCl, החל דילולים מ אולטרה-תכליתי, ריכוז 1 M) ו tetramethylammoniumhydroxide (TMAH, החל דילולים מ אולטרה פורה, ריכוז 25%). שני החומרים מאוד קורוזיביים. השתמש בהגנה על העור והעין. 1. הכנת אלקטרוליטים הכנת אלקטרוליטים HCl: אלקטרוליט רקע (20 mM HCl), אלקטרוליט שקע (5 mM HCl) וסיום אלקטרוליט (0.05 mM HCl) הכן 20 mM HCl בקבוקון 100 מ”ל: פיפטה 2 מ”ל של 1 M HCl לתוך הבקבוקון, למלא עד הסימן עם מים אולטרה פורים ולנער בעדינות. הכן 5 mM HCl בקבוקון 100 מ”ל: פיפטה 500 μL של 1 M HCl לתוך הבקבוקון, למלא את הסימן עם מים אולטרה פורים ולנער בעדינות. הכן 0.05 mM HCl בשני שלבים: פיפטה 1 מ”ל של 20 mM HCl לתוך בקבוקון 100 מ”ל, ולאחר מכן למלא את הסימן עם מים אולטרה פורים ולנער בעדינות. לאחר מכן, פיפטה 2.5 מ”ל של הפתרון האחרון לתוך צינור חורט 15 מ”ל(טבלת חומרים)ולהוסיף 7.5 מ”ל של מים אולטרה פוריים, ואז לנער בעדינות. הכנת אלקטרוליט מוביל 12% TMAH בצינור חורט 15 מ”ל: פיפטה 4.8 מ”ל של 25% TMAH לתוך הצינור, להוסיף 5.2 מ”ל של מים אולטרה פורים ולנער בעדינות.הערה: 12% TMAH משמש כדי לטהר ולנקות את הנחם לפני כל ריצה וכאלקטרוליט מוביל מול המדגם המוזרק). 2. הכנה ואחסון של תקנים ודוגמאות סטנדרטים עבור Fe(II), לשקול 35.61 מ”ג של Fe(II)Cl2·4H2O לתוך בקבוקון 100 מ”ל ולמלא עד סימן 100 מ”ל עם מים אולטרה פורים עבור 100 מ”ג Fe(II)/ L ריכוז מניות. לנער בעדינות עד פירוק מלא. עבור Fe(III), לשקול 29.04 מ”ג של Fe(III)Cl3 לתוך בקבוקון 100 מ”ל ולמלא עד סימן 100 מ”ל עם מים אולטרה פורים עבור 100 מ”ג Fe(III)/ L ריכוז מניות. לנער בעדינות עד פירוק מלא. תדלל כל פתרון סטנדרטי לפי טבלה 1 כדי להכין את הפתרונות הסטנדרטיים בעבודה.הערה: לאחר הכנת פתרונות המלאי היומיים מפתרון המניות 100 מ”ג/L, יש לאחסן את האחרון קפוא. לאחר הכנת הסטנדרטים היומיים על פי טבלה 1, פתרון מניות 1 מ”ג / L חייב להיות aliquoted לתוך 1.5 מ”ל כרכים ומאוחסנים קפוא (הטוב ביותר ללא אוויר עזב על גבי) בצינורות 1.5 מ”ל. עבור כל יום חדש, שווי מניות יומי אחד מפשיר להכנת סטנדרטים יומיים ונסוג לאחר השימוש. ריכוז התחלתי עוצמת צנרת תתמלא במים מילי-קיו ריכוז שנוצר כרך סופי שימוש בפתרון 100 מ”ג/ל’ 50 μL 4950 μL 1 מ”ג/L 50 מ”ל פתרון מניות יומי 1 מ”ג/L 200 μL 1800 μL 100 μg/ L 2 מ”ל סטנדרטי 100 μg/ L 1 מ”ג/L 100 μL 1900 μL 50 μg/L 2 מ”ל סטנדרטי 50 μg/L 1 מ”ג/L 50 μL 1950 μL 25 μg/L 2 מ”ל סטנדרטי 25 μg/L 1 מ”ג/L 25 μL בת אלון בן-4 12.5μg / L 2 מ”ל סטנדרטי 12.5 μg/ l 1 מ”ג/L 20 μL בת אלון בן-19 10 μg/ L 2 מ”ל סטנדרטי 10 μg/ L 0 2000 μL 0 μg/L 2 מ”ל ריק טבלה 1: ערכת Pipetting להכנת הסטנדרטים. תא SH-SY5Yהערה: תא ליזל (SH-SY5Y) שימש Fe(II)/(III)-רלוונטי ביו-מטריצה כדי להראות את הביצועים והאמינות של השיטה. השתמשו בניסויים שהריץ בעבר16. בצע את התא הזה lysate הכנה הימנעות שינויי pH או כימיקלים שעשויים להשפיע על יתרת redox. השתמש במאגר פירוק פירוק רדיומונו-ערך (RIPA) ששונה (PBS pH 7.4, 0.5% נתרן deoxycholate, 1% NP-40), הימנעות מכלאטורים מתכת (כגון EDTA), הפחתת סוכנים (כגון DTT, 2-Mercaptoethanol) וחומרי ניקוי פעילי שטח אניוניים וסוכני תסביך מתכת (כגון SDS) למזעור שינויים שלאחר איסוף של Fe(II)/ Fe(III). לעבוד תחת N2 -אטמוספרהמעכבת חמצון על ידי O2 מאוויר הסביבה ולעבוד על קרח כדי למזער כל autoxidation עד lysate אוחסן בהקדם האפשרי ב -80 ° C תחת אטמוספרה חנקן. 3. הגדרת מכשירים למיקוף של CE ל- ICP-MS תארגן את מכשיר האלקטרופורזה של נימה.הערה: עבור סעיף זה, הקורא מופנה בעיקר למדריך של המכשיר המתאים הזמין במעבדה. התקן נימים עם אורך מתאים להגיע ממבען תפונת המקצה של מכשיר CE לערפילית של ICP-MS. התקן את נמק רק בצד היכנס ולהוביל אותו מחוץ למכשיר לכיוון ממשק CE-ICP-MS.הערה: עבור מיקוף CE ל- ICP-MS, בפרוטוקול זה הותקן נערך סיליקה מותך 90 ס”מ (מזהה 50 μm) בהתאם לתיאור ההתקנה האינסטרומנטלית הכללית. בדרך כלל, יש צורך בגדלים ננים של 70-100 ס”מ, בהתאם למיקום המכשירים במעבדה. תסיר את הפעלת המעלית של מכשיר CE בתוכנה לפעולה חלקה מכיוון שהוא אינו בשימוש כאשר נימים מופנים החוצה לממשק CE-ICP-MS. התקן כבל הדק מ- CE-instrument trigger-OUT כדי להפעיל-IN של מכשיר ICP-MS. בחר עמדות לכל הפתרונות הדרושים (20 mM HCl, 0.05 mM HCl, 12% TMAH), תקנים ודוגמאות בדגימה ופתרונות רוטור של המכשיר ולהגדיר את מיקומם בתוכנה המכשיר כרגיל (עיין במדריך של המכשיר). בחר את טמפרטורת הרוטור והנימי להיות זהים ב- 20 °C, כמו להיות זהה לטמפרטורת המעבדה המבוקרת.הערה: לא מתרחש מעבר צבע טמפרטורה לחלקי נימו בתוך ומחוץ למכשיר CE. הגדרת מכשיר ICP-MS מטב את מכשיר ICP-MS בהתאם להליכי ההתקנה והתפעול הסטנדרטיים האינסטרומנטליים היומיים. השתמש בפרוטוקול היצרן. השתמש בטכנולוגיית תא תגובה דינמית (DRC) עם NH3 כגז DRC, עם 0.6 מ”ל/דקה NH3–flowrate וערך RPq = 0.45.הערה: עבור ספקולנטיות ברזל, שיטה מתוכנתת עם 56Fe, להיות איזוטופ Fe הנפוץ ביותר (91.754% שפע יחסי), עם זאת, להיות מפריע באופן חמור מן [40Ar16O]+ אשכול. ICP-MS מבוסס quadrupole במצב סטנדרטי הוא כמעט עיוור ואת הגלאי בגלישה איזוטופ זה. עם ההגדרות לעיל (ראה שלב 3.2.2), תוכניות בסיסיות נמוכות ורגישות גבוהה מושגות (עבור קביעת ברזל כוללת רגילה LOD בטווח ng/L נמוך מושגת). בחר הגדרת זמן שהייה לכל איזוטופ ב 50 ms לניטור אפילו חדה וקצרה מופיעה פסגות במהלך CE-הפרדת. תכנת את שיטת ICP-MS לפעלת גורם מפעיל על-ידי מכשיר CE. הגדרת ממשק CE-ICP-MSהערה: קיימות בעיקר שתי אפשרויות לחיבור נימו CE ל- ICP-MS. בצע את התיאורים שסופקו אודות תוכנית ההתקנה אם נעשה שימוש בממשק מסחרי. פרוטוקול זה משתמש בממשק ביתי פשוט המבוסס על פרסום קודם לאחר שינויים20. בעיות מפתח הן ערפילית יעילה עם אולי פחות דילול של efflux הנימי מלבד אימוץ של flowrate הכולל לערפילית עבור ערפילית הטובה ביותר. כמו כן, מזעור זרימת יניקה באמצעות הפרדת הנימי שנגרם על ידי השאיפה העצמית מערפילית, ואת החיבור החשמלי של אלקטרודה שקע מקורקע לסוף הנימי הם חובה.בחירת ערפילית השתמש בערפילית קונצנטרית עם נפח נמוך לשאף עצמי (למשל, 100 μL/min) שמתאים לתא ספריי בנפח נמוך.הערה: הספיגה הנמוכה תגרום רק דילול מתון של efflux נימו במקביל ערפילית עדיין אופטימיזציה. חיבור חשמלי של אלקטרודה שקע מושגת על ידי זרימת אלקטרוליט סביב אלקטרודה שקע וסביב הקצה נימי. השתמש בשאיפה העצמית של הערפילית כדי למזער את היניקה באמצעות הנימי המפריד ולאימוץ קצב הזרימה לערך האופטימלי הדרוש לערפילית. הכן את החלקים הבאים מטבלה 2 כדי לטעון ממשק זה מרכב ביתי. הגדרת הממשק הפשוטהערה: השתמש באות 1 כדי לעקוב אחר התיאור של הרכבה חלקית עבור הממשק הפשוט. המספרים באות 1 ובטקסט הבא מתייחסים למספרים בטבלה 2. התחל להרכיב את הממשק על-ידי חיבור שני מחברי Luer נקבה תלת-כיוון (מס’ 3) עם מחבר קונוס Luer זכר (מס’ 4). חבר את הקצה השמאלי של סרגל Luer התחתון ל-3 כיוון למחבר הגברי ואת החיבור האמצעי של Luer 3-way העליון. שים שפופרת 1 ס”מ (מס’ 1) מעל חוט ה-Pt (מס’ 7) וצינור סיליקון של 1 ס”מ (מס’ 5) מעל האחרון ועל זרבובית מחבר Luer זכר (מס’ 2). תקן את ההרכבה לחיבור האמצעי של מחבר Luer התחתון (מס’ 3) באמצעות סיבוב בורג אופייני ל-Luer. דחוף צינור 1 ס”מ (מס ‘1) מעל קצה שקע של נמת CE ולמקם אותו על 8-9 ס”מ מהסוף. שים צינור סיליקון 1 ס”מ (מס ‘ 5) על האחרון ואת זרבובית של מחבר Luer זכר (מס ‘2). מקם את כל ההרכבה משמאל דרך פס המחבר העליון של 3-way-T ותקן את מחבר Luer זכר ואת הקצה השמאלי של מחבר Luer 3-way נקבה (מס ‘ 3) על-ידי סיבוב בורג טיפוסי Luer. תקן את צינור הסיליקון ב-25 ס”מ (מס’ 5) בזרבובית של מחבר Luer זכר (מס’ 2) ותקן את כל ההרכבה בקצה התחתון (מימין) של הרף ממחבר Luer התחתון (מס’ 3) על-ידי סיבוב ברגים טיפוסי של Luer. קח את צינור סיליקון 1 ס”מ (מס ‘6) ולדחוף אותו 5 מ”מ על קצה הערפילית בחוזקה בעוד מחבר קונוס Luer זכר השני (מס ‘4) מחובר בחוזקה לחלק הבולט של צינור הסיליקון. להעביר את חלק הממשק רכוב לעיל לאחר מכן עם נערך CE בולט לקונוס זכר בערפילית. הכנס את הנמת CE בזהירות דרך הקונוס הזכר והמשך דרך החלק הרחב יותר של הנימוי הערפילי עד האחרון מקבל צר. בהתחשב בכך שהאורך הבולט של נימים נבחר כראוי, מחבר Luer 3-way הנשי העליון עכשיו גם מתאים בחוזקה לקונוס זכר. תקן את אורך אורך הניים הבולט במידת הצורך, על-ידי הזזת הניח (קדימה/אחורה) בצינור (מס’ 1) שבו נכנס לממשק מ-Self-Made.הערה: המיקום האופטימלי של הנימום CE בתחילת נימוי הערפילית אינו קריטי מדי. עם זאת, אל תדחוף את הנים CE קרוב מדי לחלק הצר של נימוי הערפילית. זה יכול לעכב או לחסום את זרימת האלקטרוליט של שקע. כמו כן, זה יפריע לחיבור החשמלי לאלקטרודת השקעים ויגדיל את היניקה באמצעות נמת CE, וכתוצאה מכך הפרדה מופרעת. בתורו, לא לשמור על קצה הנימוי CE רחוק מדי מן הנימוי הערפילי מאז פסגות מופרדות חדות יורחב ורזולוציה תאבד. השתמש בעדשה כדי לזהות את המיקום הטוב ביותר.הערה: איור 1 (מימין למטה) מציג את המיקום האופטימלי של CE-נמת בתוך הערפילית. איור 1: סכמטי והרכבה של ממשק CE-ICP-MS. השרטוט מזהה את החלקים הבודדים להרכבה צעדית של ממשק CE-ICP-MS הפשוט והזול. החלון מציג תמונה של מיקום אופטימלי של הניח CE בערפילית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. לא. חלק משמש עבור 1 צינורות (קוד צבע ירוק-כתום), 2 x ca. 1 ס”מ תיקון נערך CE ואלקטרודה שקע בחלקי Luer ולשמור הדוק 2 Luer, זכר, 3 x, מתאים 1.6 מ”מ צינורות סיליקון מזהה חיבור של צינור סיליקון לשקע אלקטרוליט וכסיוע לתיקון נערך CE ואלקטרודה חוט Pt 3 3-way-Luer, נקבה, 2 x T-pieces לחיבור אלקטרודה, נימי וזרימת שקע שאף 4 קונוס Luer, זכר, 2 x חיבור לוארס נקבה זה לזה ולערפילית 5 צינור סיליקון, מזהה 1.6 מ”מ, קיר 0.8 מ”מ, 2 x 1 ס”מ, 1x ca. 25 ס”מ א) 1 ס”מ; נמת CE הדוקינג לממשק,ב) 1 ס”מ; ההחזקה של חוט Pt לממשקג) 25 ס”מ; חיבור מבוקון אלקטרוליט שקע לממשק 6 צינור סיליקון, מזהה 3 מ”מ, קיר 1.2 מ”מ, ca.1 ס”מ הדוקינג קונוס לור לערפילית 7 חוט פלטינה אלקטרודה לשקעים טבלה 2: חלקים לבניית ממשק CE-ICP-MS הפשוט מ-2. המספרים מתייחסים גם לא איור 1 ולתיאור בטקסט. 4. הכנה למדידה הערה: לפני המדידה, יש לשטוף את הנחם בתמיסת אלקליין חזקה (כאן: 12% TMAH) לניקוי ולאחר מכן למלא אותה באלקטרוליט רקע. להפרדה משופרת נבנה כריך מאגר הערימה סביב המדגם בהתבסס על מוליכות ושוני צבע של pH. טבלה 3 מסכמת את שלבי ההכנה הרצופים של נמת הים, המעובדים באופן אוטומטי על-ידי הכלי בהתאם לשיטה מתוכנתת: שלב-לא שלב כימי תנאי   הכנת עמודת CE הכנה 1 ניקוי ננים 12% TMAH 4 בר, 1 דקות הכנה 2 טיהור נערך עם אלקטרוליט רקע 20 מ’, ה.א.ל. 4 בר, 1 דקות הכנה 3 סידור בערימה: אלקטרוליט מוביל 12% TMAH 150 mbar, 3 שניות הכנה 4 הזרקת לדוגמה 150 mbar, 3 שניות הכנה 5 סידור בערימה: הפסקת אלקטרוליט 0.05 מ” HCl 150 mbar, 3 שניות טבלה 3: שלבי הכנה ננים לפני המדידה. שלבים אלה מתוכנתים עם תוכנת CE-system בשיטת CE וכוללים הזרקת מדגם בלחץ והצטברות של “כריך סידור בערימה” סביב הדגימה. תכנת שיטת CE, אשר מבצעת ברצף את השלבים שניתנו בטבלה 3. הגדר טבלה ורצף לדוגמה בתוכנה CE והעתק רצף זה גם לתוכנת ICP-MS. 5. מדידה והערכת נתונים הפעל את השיטה בכלי CE. לאחר ההכנה והמילוי המתוכנתים של נימות, המדידה מתחילה באופן אוטומטי ברגע שמבען המיקום, המכיל 20 מ”ר HCl, נמצא במיקום במקלט נימות. “הפעלת ההדק” נשלחת ל-ICP-MS, המפעילה את הניטור התוך-ליין של איזוטופים.הערה: ההפרדה משתמשת במתח של +25 kV. האורך המורחב של הניח, הנחוץ לחיבור מכשיר CE ל- ICP-MS, גורם להארכת זמן ההפרדה שלא לצורך. לכן, ההפרדה נתמכת על ידי לחץ נמוך של 250 mbar בהכנסה. האלקטרוליט המושאף העצמי בשקע הוא 5 מ”מ HCl. הניתוח הכולל נמשך 3 דקות עבור דגימות עם מוליכות מתונה. בחלון האות של תוכנת ICP-MS ניתן לצפות אלקטרו פרוגרם במהלך הריצה. בסוף כל מדגם, שני קבצי נתונים נוצרים באופן אוטומטי, אחד נגיש רק מתוכנה מכשיר מבנק נתונים פנימי, השני בתיקיית הייצוא כמו “.xl” או “.txt” פורמט, נגיש על ידי פונקציית ייבוא מתוכנה כרומטוגרפיה רגילה. עיין במדריך התוכנה של מכשיר ICP-MS לייצוא הקבצים לתוכנת כרומטוגרפיה.