إعداد الترافيسيرات الشعرية -البلازما المقترنة الاستقرائي الطيف الطيفي (CE-ICP-MS) لقياس كمية من أنواع الأكسدة الحمراء الحديد (Fe(II), Fe(III))
Summary
ويستند هذا الأسلوب مضبوط الحديد على القياس الطيفي كتلة البلازما ذات شكلي كهربائي الشعيرية مع التراص العينة جنبا إلى جنب مع تحليل قصير في شوط واحد. هذه الطريقة بسرعة تحليل وتوفير حدود منخفضة من الكم لأنواع الأكسدة الحديد عبر مجموعة متنوعة من الأنسجة وعينات بيوفلورويد.
Abstract
يتم حساب خلل التوازن في الحديد في الإطار الفسيولوجية للعديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان والعديد من الظروف العصبية. الحديد المفرط النتائج في الحرة الأكسدة النشطة Fe(II) ويمكن أن يسبب آثارا مدمرة داخل الخلية مثل الأكسدة (OS) والموت عن طريق بيروكسيد الدهون المعروفة باسم ferroptosis (FPT). ولذلك، فإن القياسات الكمية للحديد (Fe(II)) والحديد الحديدي (Fe(III)) بدلاً من تحديد Fe الكلي هي المفتاح لنظرة أعمق إلى هذه العمليات الضارة. منذ Fe(II)/(III) يمكن أن يعوقها التحولات السريعة الدولة الأكسدة وتركيزات منخفضة في العينات ذات الصلة, مثل السائل النخاعي (CSF), ينبغي أن تكون الأساليب المتاحة التي تحلل بسرعة وتوفير حدود منخفضة من الكم (LOQ). الشعيرات الدموية الكهربائية (CE) يوفر ميزة سريع Fe(II) / Fe(III) الفصل ويعمل دون مرحلة ثابتة، والتي يمكن أن تتداخل مع التوازن redox أو يسبب الالتصاق التحليل. CE جنبا إلى جنب مع قياس الطيف كتلة البلازما جنبا إلى جنب مع الاستقراء (ICP-MS) ككاشف يوفر المزيد من التحسن في حساسية الكشف والانتقائية. الأسلوب المقدم يستخدم 20 M HCl ككهربا خلفية والجهد من +25 كيلو فولت. يتم تحسين أشكال الذروة وحدود الكشف عن التركيز عن طريق التراص الموصلية-درجة الH.0.0. للحد من 56[ArO]+، ICP -MS تم تشغيلها في وضع خلية التفاعل الديناميكي (DRC) مع NH3 كغاز تفاعل. تحقق هذه الطريقة حدًا من الاكتشاف (LOD) يبلغ 3 ميكروغرام /ل. بسبب التراص ، كان من الممكن استخدام كميات حقن أعلى دون إعاقة الفصل ولكن تحسين LOD. وكانت المعايرات المتعلقة بمساحة الذروة خطية تصل إلى 150 ميكروغرام/لتر. وكانت دقة وقت الهجرة < 3٪ لكلا النوعين، في 1:2 lysates المخفف من الخلايا الأرومية العصبية البشرية (SH-SY5Y). وكشفت تجارب الاسترداد مع إضافة القياسية دقة 97٪ Fe (III) و 105 ٪ Fe(II). في العينات الحيوية الواقعية مثل CSF، يمكن أن يختلف وقت الترحيل وفقًا لموصلية مختلفة (أي الملوحة). وهكذا، يتم تأكيد تحديد الذروة من خلال إضافة قياسية.
Introduction
اليوم، فمن الواضح أن الإجهاد التأكيدي بوساطة الحديد (OS) يلعب دورا حاسما في اضطرابات متعددة على وجه التحديد في اضطرابات الدماغ العصبية، مثل مرض الزهايمر وباركنسون وكذلك في السرطان1،2،3،4. نظام التشغيل يرتبط ارتباطا وثيقا للدولة والتوازن من زوجين redox Fe (الثاني)/Fe (الثالث). في حين Fe (III) هو الأكسدة غير النشطة، Fe (II) يولد بقوة أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) عن طريق تحفيز H2O2 التحلل تليها من إنتاج هيدروكسل الجذرية والغشاء بيروكسيديشن الدهون5،6. على المستوى الجزيئي، Fe (II) ولدت روس والفوسفوليبيدات بيروكسيدسيدات هي هجوم قوي على سلامة البروتينات والدهون والحمض النووي7،8. وقد ثبت هذا الخلل الخلوي الضارة للحث على خلل الميتوكوندريا مع انخفاض ATP-المحتوى9 ويمكن أن تؤدي حتى موت الخلايا النخرية المبرمجة، والمعروفة باسم ferroptosis (FPT)10،11. ولذلك، الكمية Fe(II)/(III) اكاسة الأكسدة ذات أهمية بارزة في مجموعة واسعة من الاضطرابات ذات الصلة الأكسدة.
اال speciation الكيميائية هي أداة راسخة لدراسة العناصر النزرة الدور البيولوجي والتمثيل الغذائي في عام7،8 وكذلك في الظروف العصبية12،13،14،15،16،17. تعتمد طرق تحديد المواصفات في الـ Fe-redox الموجودة في المؤلفات عادة على فصل اللوني السائل (LC). بعض المؤلفات استخدام البلازما يقترن الاستقرائي الطيف الكتلي (ICP-MS) كعنصر للكشف الانتقائي. ومع ذلك، في العمل LC الروتينية، كانت هناك حاجة إلى أوقات التطهير المفرطة بين التشغيل. حتى أكثر إشكالية ، دفعة إلى دفعة الاختلاف من أعمدة LC القسري إعادة تحسين ظروف elution بعد كل تغيير العمود. هذه المشاكل تعوق الإنتاجية العالية. مطلوب وقت إضافي للحصول على موثوقية مقبولة وتقييم الأسلوب بدقة مرة أخرى.
للتحايل على هذه العيوب، يتم تقديم طريقة هنا لFe(II)/Fe(III) مضد اخصائيات الأكسدة على أساس الكهربائي الشعرية يقترن INDUCTIVELY البلازما الطيف الكتل (CE-ICP-MS). تقدم CE مزايا مختلفة مقارنة بـ LC18. الشعيرات الدموية ليس لها مرحلة ثابتة، وبالتالي تعتمد (تقريبا) لا على هوية دفعة. عندما يبلغ من العمر أو المحظورة، يتم استبدالها بسرعة، وتظهر عادة أداء لم يتغير. خطوات التطهير والتنظيف بين العينات فعالة وقصيرة، ووقت التحليل لكل عينة قصير أيضاً.
الطريقة المقدمة هي موثوقة مع أرقام جيدة من الجدارة. كدليل على المبدأ، يتم تطبيق الأسلوب على الإنسان الدوبامين الورم الأرومي العصبي (SH-SY5Y) الخلية lysate، وهو نوع عينة مهمة في التنكس العصبي وكذلك أبحاث السرطان19.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ الحديد يلعب دورا بارزا في تطور نظام التشغيل، وبالتالي تسهيل الخلل الميتوكوندريا أو FTP، يتم عرض طريقة متعددة الاستخدامات CE-ICP-MS الكمية ل Fe(II) / FE (III) في هذه المقالة وتطبيقها بشكل مثالي في lysates الخلية. الطريقة المقدمة وقت التحليل القصير وأرقام الجدارة (LOQ، الدقة، الانتعاش) هي مناسبة للعينات كونها ذات الصلة ل speciation الأكسدة الحديد على وجه التحديد في البحوث العصبية والسرطان. مقارنة بالأساليب السابقة استناداً إلى LC، هذا الأسلوب المستند إلى CE هو عملياً مستقلة عن دفعات العمود والمشاكل إعادة إنتاج لوحظت سابقاً بعد تغيير عمود LC. تحضير الشعيرات الدموية قبل كل شوط هو < 4 دقائق ووقت التحليل لكل عينة مع ملوحة معتدلة تصل إلى 3 دقائق. وبصرف النظر عن تهمة الجزيء وحجمه، فإن وقت الهجرة في CZE يعتمد على التوصيلية في المكونات العينة، مما يسبب اختلاف وقت الهجرة أو التحولات عندما تؤثر العينات نفسها على الموصلية بشكل كبير. ومثل هذه التحولات في وقت الهجرة معروفة جيدا في الكهرباء الشعرية. هذه هي مشكلة CZE-immanent، والمعروفة من الأدب21،22. وكان المعايير وSSH-SY5Y lysates الخلية الموصلية المعتدلة ومتجانسة. وبالتالي، لم تظهر سوى تغييرات قليلة في أوقات الهجرة بدقة جيدة. بالنسبة للعينات ذات الموصلية العالية ، ومع ذلك ، يمكن ملاحظة أوقات الهجرة المطولة تصل إلى 5 دقائق. ولذلك، يوصى بإضافات قياسية لتحديد الأنواع بوضوح.
وهناك قضية حرجة في أطياف الأكسدة الحديد هو استقرار الأنواع (أي، صيانة Fe(II)/(III) التوازن) أثناء إعداد العينة8،13. يمكن أن تغير بسهولة درجة الأس الهيدروجيني غير الملائمة أو المواد الكيميائية الخيّرة وكذلك ظروف التخزين غير الملائمة مثل الأكسجين (الهواء) في ملامسة العينة أو كسر في التخزين العميق المجمدة توازن Fe(II)/(III). لذلك ، لإعداد lysates الخلية SH -SY5Y ، تم اختيار عازلة التحلل دون أي المواد الكيميائية chelating ، الأسي الفيزيولوجي ، ولكن تراكب الغاز الخامل أثناء إعداد العينة ، في حاويات العينة والتجميد العميق الفوري تم تطبيقه على هذه العينات.
في الأدب, واحدة يستطيع وجدت نُهُج شبه كميّة أن يراقب [فّيّ([2].. لتحسين فهم دور الحديد في الإجهاد التأكيدي، وضعت العديد من مجموعات البحث تحقيقات Fe (II) محددة لرصد شبه كمي وتصور الارتفاع الشاذ من الحديد الحديدي في المختبر. ومع ذلك ، من المهم أن نلاحظ ، مثل هذه التحقيقات لا تنظر Fe (III) ولا كمية ولكن الإبلاغ فقط “أكثر” أو “أقل” Fe (II)). حتى الآن، تتوفر مؤشرات حيوية قليلة فقط لتحديد نظام التشغيل و FPT، نظرا لعدم وجود طرق موثوقة لقياس في وقت واحد من الأنواع الحمراء Fe(II)/Fe(III)23،24. بعد أن كان هذا في الاعتبار ، فإن الطريقة المقدمة – تسهيل التحديد الكمي السريع لكل من Fe (III) و Fe(II) في شوط واحد – قد تصبح أداة واعدة لتعميق البصيرة في العمليات الجزيئية المعتمدة على الحديد.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم VV من خلال منحة البحوث داخل الأمعاء (Forschungsförderung) من المركز الطبي الجامعي غوتنغن وبرنامج أبحاث Kröner Else Kröner-Fresenius-Stiftung.
Materials
| CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
| CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
| Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
| Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
| FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
| FeCl3 | Merck | 803945 | |
| Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
| Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
| hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
| ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
| Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
| Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
| Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
| Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
| Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
| PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
| TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |
Referenzen
- Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).
- Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
- Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).
- Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
- Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).
- Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).
- Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).
- Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography – sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
- Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).
- Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).
- Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171 (2), 273-285 (2017).
- Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).
- Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).
- Neth, K. . Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. , (2015).
- Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10 (9), (2015).
- Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).
- Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson’s disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
- Thibault, P., Dovichi, N. J., Camilleri, P. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis – Theory and Practice. , 23-89 (1998).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).
- Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. . Capillary electrophoresis: Principles and practice. , (1993).
- Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).
- Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).
