Eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie -Plattform (HDX-MS) zur Untersuchung biosynthetischer Peptidenzyme

Proteine sind strukturell dynamische Moleküle, die verschiedene Konformationen auf Zeitskalen abtasten, die von Bindungsschwingungen im Femtosekundenmaßstab bis hin zu Umlagerungen ganzer Proteindomänen reichen, die über viele Sekunden auftreten können¹. Diese Konformationsschwankungen sind oft kritische Aspekte der Enzym-/Proteinfunktion. So sind beispielsweise konforme Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, oft von entscheidender Bedeutung für die Modulation der Enzymfunktion, entweder durch die Organisation aktiver Standortrückstände, die für die Katalyse benötigt werden, die Definition von Substratbindungsstellen in sequenziellen kinetischen Mechanismen, die Abschirmung reaktiver Zwischenprodukte von der Umgebung oder durch Modulation der Enzymfunktion über allosterische Netzwerke. Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass die konforme Dynamik während der gesamten Evolution konserviert werden kann und dass Störungen zu konservierten molekularen Bewegungen mit Veränderungen der Substratspezifität und der Entstehung neuer Enzymfunktionen^korreliertwerden können 2^,3.

In den letzten Jahren hat sich die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) schnell als eine leistungsstarke Technik entwickelt, um zu untersuchen, wie Proteinkonformationslandschaften auf Störungen wie Ligandenbindung oder Mutagenese^4,5,6,7reagieren. In einem typischen HDX-MS-Experiment (Abbildung 1) wird ein in_D2O hergestelltes Protein in einen Puffer gegeben, der den Austausch von lösungsmittelaustauschbaren Protonen durch Deuteria auslöst. Die Wechselkursrate der Amid-Feuchtigkeit der Peptidbindungen hängt stark vom pH-Wert, der lokalen Aminosäuresequenz und der lokalen strukturellen Umgebung des Amids⁸ab. Amide, die mit Wasserstoffbindungswechselwirkungen (wie sie in α-Helices und β-Blättern vorhanden sind) tätig sind, tauschen sich langsamer aus als Amide in unstrukturierten Regionen des Proteins, die Massenlösungsmitteln ausgesetzt sind. Somit spiegelt das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die Struktur des Enzyms wider. Enzyme, die konform dynamisch sind oder bei Ligandenbindung strukturelle Übergänge durchlaufen, würden eine messbare HDX-Antwort liefern.

Die mechanistische Grundlage für den langsamen Wechselkurs eines strukturierten Amids ist in Abbildung 2^5,8,9dargestellt. Um HDX zu durchlaufen, muss der strukturierte Bereich zunächst eine entfaltete Konformation vorübergehend abtasten, so dass die Lösungsmittelmoleküle, die den HDX-Austausch über einen bestimmten säure-basenchemischen Mechanismus katalysieren, Zugang zum austauschbaren Amid haben. Letztlich bestimmen die relativen Größen des chemischen Wechselkurses (k_chem) und die Falt- und Umfaltraten (k_offen und k_schließen) die im Experiment^gemesseneHDX-Rate 5^,8. Aus diesem einfachen kinetischen Modell geht klar hervor, dass das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die zugrunde liegende Konformationsdynamik widerspiegelt (wie definiert durch k_offen und k_close). Die meisten HDX-MS-Experimente werden in einem Bottom-up-Workflow durchgeführt, bei dem nach der Austauschreaktion das von Interesse kommende Protein in Peptide verdaut wird und die Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid als Erhöhung der Masse⁷gemessen wird. Auf diese Weise ermöglicht HDX-MS die Zuordnung von Störungen der Enzym-Konformationsdynamik auf der lokalen räumlichen Skala von Peptiden, sodass der Forscher beurteilen kann, wie die Störung die Dynamik in verschiedenen Regionen des Enzyms von Interesse verändert.

Die Vorteile des HDX-MS-Ansatzes zur Aufklärung der Proteinstrukturdynamik sind zahlreich. Zunächst kann die Methode mit kleinen Mengen an nativem Protein oder auf Proteinkomplexen in Systemen mit quartärer Struktur¹⁰durchgeführt werden. Es ist nicht einmal notwendig, dass die im Test verwendete Enzympräparation hochgereinigt wird^11,12, solange der Bottom-up-HDX-MS-Workflow eine ausreichende Anzahl von sicher identifizierten Peptiden bietet, die die Proteinsequenz von Interesse abdecken. Darüber hinaus kann HDX-MS Informationen über konforme Dynamiken unter nahezu nativen Bedingungen bereitstellen, ohne dass eine standortspezifische Proteinkennzeichnung erforderlich ist, wie sie in Einzelmolekülfluoreszenzstudien¹³verwendet würde, und es gibt keine Größenbeschränkung für den Protein- oder Proteinkomplex, die untersucht werden kann (was Ansätze wie Kernspinresonanz [NMR] Spektroskopie schwierig macht)^7,14. Schließlich können zeitaufgelöste HDX-MS-Methoden eingesetzt werden, um intrinsisch ungeordnete Proteine zu untersuchen, die mit Röntgenkristallographie^15,16,17,18schwer zu untersuchen sind. Die Hauptbeschränkung von HDX-MS ist, dass die Daten von geringer struktureller Auflösung sind. HDX-MS-Daten sind nützlich, um darauf hinzuweisen, wo sich die Konformationsdynamik ändert, und um gekoppelte Konformationsänderungen aufzudecken, aber sie bieten oft nicht viel Einblick in den genauen molekularen Mechanismus, der die beobachtete Veränderung antreibt. Jüngste Fortschritte in der Kombination von Elektronenfang-Dissoziationsmethoden mit Protein-HDX-MS-Daten haben gezeigt, dass Austauschstellen zu einzelnen Aminosäurerückständen¹⁹zugeordnet werden können, aber nachfolgende biochemische und strukturelle Studien sind immer noch häufig erforderlich, um Klarheit für Strukturmodelle zu schaffen, die von HDX-MS-Daten übermittelt werden.

Nachfolgend wird ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung eines HDX-MS-Assays vorgestellt²⁰. Die nachstehend vorgestellten Probenvorbereitungsprotokolle sollten allgemein für jedes Protein gelten, das eine gute Löslichkeit in wässrigen Puffern aufweist. Speziellere Probenvorbereitungsmethoden und HDX-MS-Workflows stehen für Proteine zur Verfügung, als in Gegenwart von Waschmitteln oder Phospholipiden^21,22,23,24untersucht werden müssen. Instrumentale Einstellungen für die HDX-MS-Datenerfassung werden für ein hochauflösendes Quadrupol-Massenspektrometer beschrieben, das an das Flüssigchromatographiesystem gekoppelt ist. Daten von ähnlicher Komplexität und Auflösung könnten auf einem der handelsüblichen Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Systeme (LC-MS) gesammelt werden. Wichtige Aspekte der Datenverarbeitung mit einem kommerziell erhältlichen Softwarepaket werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Wir stellen auch Richtlinien für die Datenerhebung und -analyse vor, die mit den Empfehlungen der breiteren HDX-MS-Community¹²übereinstimmen. Das beschriebene Protokoll wird verwendet, um die dynamischen strukturellen Eigenschaften von HalM2 zu untersuchen, einer Lanthipeptid-Synthetase, die die mehrstufige Reifung eines antimikrobiellen Peptids²⁰katalysiert. Wir veranschaulichen, wie HDX-MS verwendet werden kann, um Substratbindungsstellen und allosterische Eigenschaften aufzudecken, die einer vorherigen Charakterisierung entgangen sind. Mehrere andere Protokolle zum Protein HDX-MS wurden in den letzten Jahren veröffentlicht^25,26. Zusammen mit der vorliegenden Arbeit sollten diese früheren Beiträge dem Leser eine gewisse Flexibilität im experimentellen Design bieten.