ホスト範囲と視覚選択を用いた組換えポックスウイルスの迅速かつシームレスな生成
Summary
これは、組み換えウイルスの宿主範囲選択および視覚的同定を用いて「瘢痕のない」組換えワクシニアウイルスを生成する方法である。
Abstract
ワクシニアウイルス(VACV)は天然痘の原因物質であるバリオラウイルス(VARV)を自然から根絶するのに役立った。ワクチンとして初めて使用されて以来、ワクチンのベクターとして、また、癌性ウイルスとして開発されてきました。これらのアプリケーションは、VACVの容易に操作されたゲノムおよび広い宿主範囲を優れたプラットフォームとして利用し、様々な治療用途を有する組換えウイルスを生成する。マーカー選択法や過渡性優先選択を含む組換えVACVを生成するためにいくつかの方法が開発されています。ここでは、組換えウイルスの視覚的同定と相まって、宿主範囲選択方法の改良を提示する。我々の方法は、宿主抗ウイルスタンパク質キナーゼR(PKR)によって生成される選択的圧力を、2つのVACV PKRアンタゴニストの1つであるmCherryタグ付きE3Lを発現する蛍光融合遺伝子と相まって利用する。カセットには、対象遺伝子およびmCherry-E3L融合を含む、VACVゲノムに由来する配列によって横たわっている。対象遺伝子とmCherry-E3Lとの間には、3’アームの最初の〜150ヌクレオチドと同一である小さい領域であり、選択後のmCherry-E3L遺伝子の相同組換えおよび喪失を促進する。我々は、この方法が、薬物選択や変異型ウイルスの広範なスクリーニングを必要とせずに、様々な細胞型における効率的でシームレスなrVACVの生成を可能にすることを実証する。
Introduction
ワクシニアウイルス(VACV)は、自然からヒト病原体、バリオラウイルス(VARV)の最初の成功した根絶に役立ちました。バリオラウイルスの駆除以来、VACVを含むポックスウイルスは、ヒトおよび動物医学の両方に有用な治療ウイルスであり続けています。例えば、VACVベースの狂犬病ウイルスワクチンは、欧州1及び米国2におけるシルベージ狂犬病の感染を予防するのに非常に有効であった。さらに最近では、様々な抗腫瘍分子(例えば、単鎖抗体またはヒトエリスロポエチン)を発現する組換えポックスウイルスは、腫瘍分解剤33、4、54,5として励ましの成功を見ている。VACVは、遺伝子操作に容易に適性であるためベクターとして特に魅力的であり、広い宿主範囲を有し、かつ様々な条件下で安定であり、フィールド66,77における容易な輸送およびワクチンの生存率を可能にする。実験室実験やワクチン生成のための組換えVACVを生成する複数の技術が開発されているが、これらのウイルスを生成するための現在の戦略には顕著な限界がある。
VACVの有用性により、組換えウイルスを生成する複数の戦略が開発されている。第1の戦略は、抗生物質耐性遺伝子などのトランスジーンおよび選択可能マーカー遺伝子を含むカセットを導入するために相同組換えを採用する。カセットは、2〜500ヌクレオチド(nt)以上の腕によって横にされ、遺伝子をウイルスゲノムの特定の部位に導き、その後、二重交差事象88、9、109,10によって安定的に統合される。この戦略は迅速かつ効率的です。しかし、それは予期しない効果を生み出す可能性のあるマーカー遺伝子の形で余分な遺伝物質をもたらす。さらに、利用可能なユニークな選択可能なマーカーの数によって制限される導入可能なトランス遺伝子の数に実用的な上限がある。一時的な支配的選択(TDS)戦略は、「瘢痕のない」組換えウイルス11の生成を促進することによってこの問題に対処してきた。この戦略を用いて、変異型VACV遺伝子と選択マーカー遺伝子を含むプラスミドをウイルスゲノムに統合するが、追加の隣接するVACV DNAは含まない。このアプローチは、単一のクロスオーバーイベントによる統合の結果として、プラスミド全体の一過性の統合とVACV遺伝子の重複をもたらす。この中間体は、選択圧力下で維持される限り安定であり、この構成体の濃縮を可能にする。選択が除去されると、VACVの複製は、プラスミドの除去と野生型(wt)または組換えウイルスのおよそ50:50比のいずれかで形成される第2のクロスオーバー事象を可能にする。TDSは、外来DNAの安定した導入を必要とせずに組換えウイルスを生成する一方で、複数のウイルスクローンをシーケンシング分析、潜在的に時間とコストのかかるステップによって予想される突然変異をスクリーニングする必要があります。
ここでは、これらのアプローチのそれぞれの最良の側面を組み合わせた組換えポックスウイルスを生成するアプローチを提示し、複製無能修飾ワクシニアアンカラ12、13、1413,14に対12して説明されているアプローチと同様である。この戦略は、視覚的およびホスト範囲の選択を組み合わせて、二重交差事象によって組換えウイルスを迅速に生成し、その後、相同組換えによって選択可能なマーカー遺伝子を排除する。このアプローチは、相同組換えによって媒介される突然変異体の迅速な生成を可能にし、TDSアプローチの「スカーレス」性質を有する一方で、野生型および変異型ウイルスを区別するためのその後のスクリーニングステップを必要としない。我々の方法はまた、抗生物質選択の代わりに宿主範囲選択を使用し、細胞株中の化学的に誘発されたフェノールの変化のリスクを排除する。このアプローチでは、組換えVACVを生成する選択剤として、宿主抗ウイルスタンパク質キナーゼR(PKR)を用いることを選択しました。PKRは、ほとんどの細胞タイプ15において非活性モノマーとして表される。N末端dsRNA結合ドメインで二本鎖RNA(dsRNA)を結合すると、PKRは二量体化し、自己リン酸化された16である。このPKRの活性型は、真核生物開始因子2(eIF2)のαサブユニットをリン酸化し、最終的には開始メチオニルtRNAのリボソームへの送達を阻害し、それによって細胞内翻訳を防止し、多くのウイルスファミリー17,18,18の複製を広く阻害する。
PKRの広範かつ強力な抗ウイルス活性に応答して、多くのウイルスはPKR活性化を防ぐために少なくとも1つの戦略を進化させた。ポックスウイルスの大部分は、2つのPKRアンタゴニストを発現し、VACV中のE3LおよびK3L遺伝子によってコードされ、2つの異なる機構19を介してPKRに拮抗する。E3は、二本鎖RNA20,21と結合することによりPKRホモジマー化を防ぎ、K321は活性化されたPKRに直接結合することにより擬似基質阻害剤として作用し、それによってその基質eIF2α22との相互作用を阻害する。22重要なことに、これら2種のPKRアンタゴニストは、必ずしもすべての種からPKRを阻害するわけではない。例えば、羊痘ウイルスからのK3ホモログは羊由来のPKRを強く阻害し、一方、シープポックスE3ホモログは、かなりのPKR阻害23、24,24を示さなかった。本研究では、蛍光選択と組み合わせたPKR媒介性選択的圧力を用いて、多様な種由来のPKRの有能な細胞では複製できないE3LおよびK3L(VC-R4)に対して削除されたVACV組換え体を生成する方法を提示する。この組換えウイルスは、ネイティブE3Lプロモーターの制御下で遺伝子を発現する組換えウイルスの迅速な生成のための優れた背景を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、最終組換えウイルスに外来DNAを保持せずに組換えワクシニアウイルスを生成する過渡マーカー選択戦略32のバリエーションを提示する。我々の戦略は、抗生物質などの選択的圧力の他の形態ではなく、宿主抗ウイルスタンパク質PKRによって媒介される選択的圧力を使用する。宿主抗ウイルス遺伝子の使用は、細胞内の化学的に誘発された表型変化の可能性、また?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、国立衛生研究所(AI114851)がSRに資金を提供しました。
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
Referenzen
- Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
- Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
- Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
- Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
- Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
- Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
- COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
- Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
- Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
- Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
- Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
- Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
- Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
- Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
- Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
- Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A – G mismatch and noncontigous helixes. Biochemie. 37 (18), 6303-6316 (1998).
- Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
- Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
- Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
- Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
- Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
- Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
- Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
- Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
- Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemie. 86, 2172-2175 (1989).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
- Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
- Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
- Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
- Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).
