Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Vaccinia virus (VACV) was instrumenteel voor de eerste succesvolle uitroeiing van een menselijke ziekteverwekker, variola virus (VARV), uit de natuur. Sinds de uitroeiing van het variolavirus zijn poxvirussen, waaronder VACV, nog steeds nuttige therapeutische virussen voor zowel de menselijke als de diergeneeskunde. Zo is een vaccin tegen rabiës door VACV zeer effectief geweest bij het voorkomen van overdracht van sylvatische rabiës in Europa¹ en de Verenigde Staten². Meer recent hebben recombinante poxvirussen die een verscheidenheid aan anti-tumormoleculen uitdrukken (bijvoorbeeld single-chain antilichamen of menselijke erythropoietine) bemoedigend succes gezien als oncolytische middelen^3,4,5. VACV is bijzonder aantrekkelijk als vector omdat het gemakkelijk vatbaar is voor genetische manipulatie, beschikt over een breed scala aan gastheer, en het is stabiel onder een verscheidenheid van voorwaarden, waardoor gemakkelijk transport en vaccin levensvatbaarheid in het veld^6,7. Terwijl meerdere technieken zijn ontwikkeld om recombinant VACV genereren voor laboratoriumexperimenten en vaccin generatie, huidige strategieën om deze virussen te genereren hebben opmerkelijke beperkingen.

Vanwege het nut van VACV zijn er meerdere strategieën ontwikkeld om recombinante virussen te genereren. De eerste strategie maakt gebruik van homologe recombinatie om een cassette met het transgene en een selecteerbaar markergen zoals een antibioticaresistentiegen te introduceren. De cassette wordt geflankeerd door twee ~ 500 nucleotiden (nt) of grotere armen die het gen naar een specifieke plaats in het virale genoom leiden, die vervolgens stabiel wordt geïntegreerd door dubbele crossover gebeurtenissen^8,9,10. Deze strategie is snel en efficiënt; het resulteert echter in extra genetisch materiaal in de vorm van het markergen dat onverwachte effecten kan veroorzaken. Bovendien is er een praktische bovengrens aan het aantal transgenen dat kan worden ingevoerd beperkt door het aantal unieke selecteerbare markers beschikbaar. Voorbijgaande dominante selectie (TDS) strategieën hebben dit probleem aangepakt door het vergemakkelijken van de generatie van “littekenloze” recombinant virussen¹¹. Met behulp van deze strategie worden een plasmide met een gemuteerd VACV-gen en een selecteerbaar markergen geïntegreerd in het virale genoom, maar zonder extra flankerend VACV-DNA. Deze aanpak resulteert in een tijdelijke integratie van het gehele plasmideen en duplicatie van het VACV-gen als gevolg van integratie door één cross-overgebeurtenis. Dit tussenproduct is stabiel zolang het onder selectiedruk wordt gehandhaafd, waardoor verrijking van deze constructie mogelijk is. Wanneer de selectie wordt verwijderd, maakt de VACV-duplicatie een tweede crossover-gebeurtenis mogelijk die resulteert in het verwijderen van het plasmilaatpunt en de daaropvolgende vorming van het wilde type (wt) of recombinantvirus in een verhouding van ongeveer 50:50. Terwijl TDS recombinante virussen genereert zonder de stabiele introductie van vreemd DNA, moeten meerdere virusklonen worden gescreend op de verwachte mutatie door sequencing analyse, een potentieel tijdrovende en kostbare stap.

Hier presenteren we een benadering voor het genereren van recombinante pokkenvirussen die de beste aspecten van elk van deze benaderingen combineren, vergelijkbaar met een benadering die is beschreven voor de replicatie incompetente gemodificeerde vaccinia Ankara^12,13,14. Deze strategie combineert visuele en gastheer bereik selectie om snel recombinante virussen te genereren door dubbele crossover gebeurtenissen, en vervolgens elimineren van de selecteerbare marker gen door homologe recombinatie. Deze aanpak maakt de snelle generatie mutanten bemiddeld door homologe recombinatie, met de “littekenloze” aard van TDS benaderingen, terwijl niet vereist een latere screening stap om wilde type en mutant virussen te onderscheiden. Onze methode maakt ook gebruik van gastheer bereik selectie in plaats van antibiotica selectie, waardoor het risico van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in de cellijn. Voor deze aanpak hebben we ervoor gekozen om de gastheer antivirale eiwit kinase R (PKR) te gebruiken als het selectieve middel om recombinant VACV te genereren. PKR wordt uitgedrukt als een inactieve monomeer in de meeste celtypen¹⁵. Na het binden van dubbelstrengs RNA (dsRNA) bij de N-terminal dsRNA-bindende domeinen, dimerizes PKR en wordt autophosphorylated¹⁶. Deze actieve vorm van PKR-fosforylaatse de alfa-subeenheid van de eukaryotische initiatiefactor 2 (eIF2) remt uiteindelijk de levering van initiator methionyl-tRNA aan het rinoom, waardoor intracellulaire vertaling wordt voorkomen en de replicatie van veel virusfamilies^17,18in grote lijnen wordt geremd .

In reactie op de brede en krachtige antivirale activiteit van PKR, veel virussen hebben ontwikkeld ten minste een strategie om PKR activering te voorkomen. De meeste poxvirussen drukken twee PKR antagonisten uit, gecodeerd door de E3L en K3L genen in VACV, die PKR door twee verschillende mechanismen antagonize¹⁹. E3 voorkomt PKR homodimerisatie door binding van dubbelstrengs RNA^20,21, terwijl K3 fungeert als een pseudosubstraatremmer door direct te binden aan geactiveerde PKR en daarmee de interactie met het substraat eIF2α²²te remmen . Belangrijk is dat deze twee PKR-antagonisten pkr niet noodzakelijkerwijs van alle soorten remmen. Zo remde de K3 homolog van het schapenpokkenvirus PKR sterk van schapen, terwijl de schapenpokken E3 homolog geen aanzienlijke PKR-remming^23,24. In deze studie presenteren we een methode om PKR-gemedieerde selectieve druk te gebruiken in combinatie met fluorescentieselectie om een VACV-recombinant te genereren die is verwijderd voor E3L en K3L (VC-R4), die niet kunnen repliceren in PKR-competente cellen afkomstig van verschillende soorten. Dit recombinant virus biedt een uitstekende achtergrond voor snelle generatie van recombinante virussen uitdrukken genen onder controle van de inheemse E3L promotor.