カエノハブディティス・エレガンスにおける熱ショック応答の誘導を測定するための標準化された方法

1. C.エレガンスのメンテナンスと同期 週10に約2倍の新鮮なプレートに数人の成人を移すことによって、OP50大腸菌を播種した線虫成長培地(NGM)プレート上の20°Cでワームを維持する。これは彼らの生理学11に影響を与える可能性があるため、ワームが食物を使い果たさないように注意する必要があります。 NGMプレートの調製。 NaClの3g、バクトペプトン2.5g、寒天20g、および脱イオン化(DI)H2Oをフラスコ2中1Lまで混合する。 殺菌のための混合物をオートクレーブ。 混合物を~50°Cに冷却します。 1 M KH2PO4(pH =6)の25mL、1MCaCl2の1mL、1M MgSO4の1mL、および1mLのコレステロール(5mg/mLの100%エタノール)を加える。 滅菌技術を使用して、約100プレートを得るために6 cmプレートに混合物を注ぎます。混合液が最初に300 mLの滅菌ビーカーに移された場合、プレートを注ぎ込む方が容易です。 細菌で播種するか、4°Cで保存する前に、室温(RT)で固化するために1日を許可します。 NGMプレートにOP50バクテリアを播種する。 飽和した一晩OP50細菌培養物をLBで30°Cまたは37°Cで増殖させる。 培養液の約300μLを6cmNGMプレートの中心に配置します。 細菌の芝生がプレートに付着するために必要に応じて1〜3日間RTでプレートを乾燥させます。その後、プレートを4°Cで使用または保存することができます。 産たばかりの卵(ここで説明)を単離するか、漂白剤でワームを溶解した後に卵を採取することによって、ワームを同期的に成長させます。 プラチナワイヤーピックを使用して、約10グレイド成虫を新鮮なプレートに移します。卵子の同期は、成人が成人の初日である場合に最も効果的です。 約1時間後、プレートからワームを取り除きます。これは、条件と株に応じて、プレートあたり40〜60卵をもたらすはずです。 HSRレポーターの蛍光イメージング ワーム(セクション1.2)を同期し、望ましい発達段階まで20°Cで維持します。AM446(hsp-70p::gfp)およびCL2070(hsp-16.2p::gfp)蛍光レポーター株の場合、まだ生殖成熟度に達していない若年成虫は、産卵同期後64時間生成される。注: 発生タイミングは、各菌株とワームが発生する温度によって異なります。両方のHSRレポーター株は、N2に対してわずかな発達遅延を示す。重要なのは、生殖成熟の発症後、HSR誘導の大きさは約2〜4倍低下することです(議論参照)。 パラフィンフィルムでプレートを包み、33°Cの循環水浴に1時間浸水してワームに熱衝撃を与える。パラフィンフィルムの薄いストリップは、エッジを密封するためにプレートの周りに2倍を包む必要があります。プレートの底部を覆わないか、熱伝達を妨げる可能性があります。試験管ラックと鉛重量を使用してプレートを逆さまに沈下します。必要に応じて、負のコントロールサンプル(ヒートショックなし)を含めておいてください。注:パラフィンフィルムが安全でない場合は、水がプレートに入り、プレートをデータ収集に使用しないでください。 水浴からプレートを取り出し、ペーパータオルで乾燥させることで、ワームを回復します。パラフィンフィルムを取り出し、20°Cで6〜24時間インキュベートします。この回復期間は、イメージングの前にGFPの合成と折り畳みのための十分な時間を可能にします。 イメージング用のスライドを準備します。スライドは、使用するたびに新しい準備をする必要があります。 水中に3%のアガロース溶液を作り、アガロースが溶解するまで電子レンジを使用して加熱します。 他の2つの顕微鏡スライドの間に、ラボテープのストリップを持つ顕微鏡スライドを配置し、アガロースパッド用のスペーサーを作成します。 1,000 μL ピペットを使用して、加熱した 3%のアガロースの滴(約 150 μL)を顕微鏡スライドの中央に置きます。 顕微鏡スライドを最初のスライドに垂直なブランクの顕微鏡スライドで直ちに覆い、上部スライドが隣接するスライドの実験室テープの上に置くようにします。これはアガロースの滴を広げ、均一な幅のパッドを作り出す。 上のスライドを慎重に取り外します。 200 μL ピペットを使用して、M9 バッファに 1 mM レバミソールの小さなドロップ (約 5 μL) をアガロース パッドの中央に追加して、ワームを固定化します。その後、プラチナワイヤーピックを使用してレバミゾールのドロップに10ワームを転送します。カバースリップで覆います。カバースリップを密封することは、直立した顕微鏡のために必要ではない。必要に応じて、レバミゾールをアガロースパッドの外側に広げ、白金ワイヤーピックでワームを整列させることによって、ワームが麻痺したときに、ワームを整列させることができます。あるいは、レバミゾールは実験室のワイプを使用して浸すことができる。注:レバミゾールの長時間のインキュベーションは蛍光を変える可能性があるため、できるだけ早く画像を作成します。 蛍光顕微鏡を使用してワームを画像化します。画像キャプチャの詳細は、顕微鏡とソフトウェアによって異なります。注: 画像の強度を直接比較するには、1 回のイメージング セッションで同一の顕微鏡設定を使用します。画像の過剰な飽和は避けてください。 3. RT-qPCRを用いたHSR遺伝子発現の測定 ワーム(セクション1.2)を同期し、必要な発達段階まで20°Cで維持します。N2ワームの場合、まだ生殖成熟に達していない若い成虫は、産卵同期後60時間で生成される。注: 発生タイミングは、各菌株とワームが発生する温度によって異なります。重要なのは、生殖成熟の発症後、HSR誘導の大きさは約2〜4倍低下することです(議論参照)。 ステップ2.2に記載されたヒートショックワーム。 水浴からプレートを取り出し、パラフィンフィルムを取り出し、すぐにワームを収集します。M9の1mLでプレートを穏やかに洗浄し、マイクロ遠心チューブに液体を集め、400xgでM9を1分間遠心して取り除くことで、ワームを採取することができます。 g ワームをライゼし、有機抽出を使用してRNAを精製します。 RNA分離試薬を250μL追加します(材料表を参照)。 30 sのための手で渦管。 マイクロ遠心分離管の取り付け具を用いて4°Cで20分間の渦管(材料表を参照)。 クロロホルムを50μL加えます。 30 sのための渦。 RTで3分間サンプルをインキュベートします。 4°Cで15分間≥14,000 x gで遠心分離機。 水性層(すなわち、最上層、~125μL)を新しいマイクロ遠心管に移します。注: 有機層と、インターフェイス内のマテリアルは使用しないでください。 クロロホルムを50μL加えます。 30 sのための渦。 RTで3分間サンプルをインキュベートします。 4°Cで5分間≥14,000 x gで遠心分離機。 水性層(約100μL)を新しいマイクロ遠心チューブに移します。注: 有機層と、インターフェイス内のマテリアルは使用しないでください。 イソプロパノールの等しい体積(すなわち、100 μL)のRNAを沈殿させてください。 -20°Cで30分以上インキュベートするが、好ましくは一晩。注:実験はここで一時停止することができ、RNAは-20°Cで保存することができます。 4°Cで≥30分の≥14,000 x gで遠心分離によるRNAをペレット。 ペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を取り除く。注:ペレットは小さく表示されない場合があります。ペレットはチューブの側面にしっかりと付着しない可能性があるため、ペレットの外れを避けるため注意が必要です。 ペレットをRNaseフリーH2Oで作った70%氷冷エタノール250μLで洗浄します2。 4°Cで≥5分の≥14,000 x gで遠心分離機。 ペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を除去します。 RTでクイックスピンを行い、残りの70%エタノールを除去します。 必要に応じて、チューブをRTで開いたままにしてペレットを乾燥させます。通常、少なくとも20分チューブは、汚染を防ぐために、糸くずのない組織またはアルミニウム箔で覆うことができます。 ペレットをRNaseフリーH2Oの20 μLで再懸濁します。 小容量分光光度計(2μL)を用いてRNA濃度を測定します。注:実験はここで一時停止することができ、RNAは-20°C以下で一時的に保存することができます。 DNase Iでインキュベートすることにより残存DNAを除去する。市販のキット (資料一覧を参照) を使用し、製造元の指示に従うことをお勧めします。 このキットでは、37°Cの水浴に500ngのRNAと1μLのDNase Iで30分間の20μL反応を準備します。 各サンプルに2.5 μLのDNase不活性化試薬(キットに含まれる)を加え、RTで5分間、時折フリック/渦を引き起こします。 14,000 x gで 2 分間スピンダウンします。 白いペレットを邪魔することなく、15 μLの上清を新鮮なマイクロチューブに移してcDNA合成を行います。 cDNA合成を行う。市販のキット (資料一覧を参照) を使用し、製造元の指示に従うことをお勧めします。 キットでは、前のステップのDNase I処理RNAを15μL、逆転写酵素を1μLで20μL反応させます。 cDNA合成には、25°C、20分間46°C、1分間95°C、4°Cホールドのプログラムを使用してください。 80 μLのRNaseフリーH2Oをサンプルに直接加えてcDNAを希釈します。 短い渦を、スピンダウンし、必要になるまで-20°Cで保存します。 qPCR を実行します。市販のキット (資料一覧を参照) を使用し、製造元の指示に従うことをお勧めします。 キットでは、2 μL の cDNA と 200 nM (それぞれ) のフォワードおよびリバースプライマーを含む 25 μL の反応を 96 ウェル プレートの 1 つのウェルに用意します。 ヒートショック遺伝子を測定するためのプライマー配列は、hsp-70およびhsp-16.2、および18S rRNA(正規化制御用)を材料表に列挙する。必要に応じて、複数の正規化コントロールを使用できます。 18Sの測定前に50倍のcDNAサンプルを希釈し、アッセイが線形範囲にあることを確認した。適切なqPCR条件は、使用するキットとプライマーによって異なります(代表結果を参照)。 5s変性の場合は95°Cの40サイクル、30 sアニーリングの場合は58°C、30 s延長の場合は72°CのqPCRにはリアルタイムPCR検出システム(材料表を参照)を使用します。注: 最適なアニーリング温度はプライマーや条件によって異なる場合があります。 ΔΔCt法または標準曲線法12を使用して定量化する。 4. 生物レベルでHSRを測定するための熱回収アッセイ ワーム(セクション1.2)を同期し、望ましい発達段階まで20°Cで維持します。N2ワームの場合、まだ生殖成熟に達していない若い成虫は、産卵同期後60時間で生成される。注: 発生タイミングは、各菌株とワームが発生する温度によって異なります。重要なのは、生殖成熟の発症後、HSR誘導の大きさは約2〜4倍低下することです(議論参照)。 ステップ2.2で説明したとおりにワームに熱衝撃を与える。 水浴からプレートを取り出し、パラフィンフィルムを取り除き、20°Cで48時間インキュベーションして回収させます。 ぎくしゃくした動きや麻痺なしに機械的刺激の後すぐに這い去ることができるワームの数を数えます。注:6時間のインキュベーションは熱回収を減らす条件を調べるのに最適ですが、熱回収を強化する条件を探すためにより長い暴露時間が必要な場合があります。