Her præsenteres standardiserede protokoller for at vurdere induktion af varmechokresponsen (HSR) i Caenorhabditis elegans ved hjælp af RT-qPCR på molekylært niveau, fluorescerende journalister på celleniveau og thermorecovery på organismalniveau.
Den varme chok respons (HSR) er en cellulær stress respons induceret af cytosolic protein misfolding, der fungerer til at genoprette protein folde homøostase, eller proteostase. Caenorhabditis elegans indtager en unik og kraftfuld niche for HSR forskning, fordi HSR kan vurderes på molekylære, cellulære, og organismeniveau. Derfor kan ændringer på molekylært niveau visualiseres på celleniveau, og deres indvirkning på fysiologien kan kvantificeres på organismalniveau. Mens analyser til måling af HSR er ligetil, variationer i timing, temperatur og metode, der er beskrevet i litteraturen gør det udfordrende at sammenligne resultater på tværs af undersøgelser. Desuden fungerer disse spørgsmål som en barriere for alle, der ønsker at indarbejde HSR-analyse i deres forskning. Her præsenteres en række protokoller til måling af induktion af HSR på en robust og reproducerbar måde med RT-qPCR, fluorescerende reportere og en organismeorisk thermorecovery-analyse. Derudover viser vi, at en udbredt termosttoleranceanalyse ikke er afhængig af den veletablerede master regulator af HSR, HSF-1, og derfor ikke bør anvendes til HSR forskning. Endelig, variationer i disse analyser findes i litteraturen diskuteres og bedste praksis er foreslået for at hjælpe standardisere resultater på tværs af området, i sidste ende lette neurodegenerative sygdomme, aldring, og HSR forskning.
Varmechokresponsen (HSR) er en universel cellulær stressrespons fremkaldt af cytosolic proteinfejlfolding forårsaget af temperaturstigninger og andre proteotoksiske belastninger. Aktivering af HSR i Caenorhabditis elegans fører til transskriptionel upregulation af varmechok gener såsom hsp-70 og hsp-16.2. Mange varmechok proteiner (HSP) fungerer som molekylære chaperoner, der genopretter protein folde homøostase, eller proteostase, ved direkte at interagere med fejlfoldede eller beskadigede proteiner. HSR’s hovedregulator er transskriptionsfaktoren Heat Shock Factor 1 (HSF-1), hvis aktivering styres elegant via flere mekanismer1.
HSF-1’s rolle er ikke begrænset til stress. HSF-1 er nødvendig for normal vækst og udvikling, som sletning af hsf-1 fører til larve anholdelse2. HSF-1 er også vigtigt under aldring og aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved ophobning af protein aggregater og en manglende evne til at opretholde proteostase. Knockdown af hsf-1 forårsager ophobning af proteinaggregater og en forkortet levetid, mens overekspression af hsf-1 reducerer protein sammenlægning og forlængerlevetiden 3,4. Derfor har regulering af HSF-1 på molekylært niveau brede konsekvenser for organismal fysiologi og sygdom.
C. elegans er en kraftfuld model organisme for HSR forskning, fordi HSR kan måles på molekylære, cellulære, og organismeniveau4,,5,6. Fremhæve magt denne model, centrale fremskridt i delineating HSR vej, såsom væv-specifikke forskelle i HSR regulering, er blevet opdaget i C. elegans7,8. Desuden er C. elegans meget udbredt til aldrende forskning og er et nyt system til modellering af sygdomme forbundet med proteostase forstyrrelser.
Selvom varmechok eksperimenter med C. elegans kan være hurtig og reproducerbar, der er flere spørgsmål at overveje, før du begynder. For eksempel, hvilken temperatur skal anvendes til induktion af HSR og hvor længe skal ormene blive udsat? Er det bedre at bruge en tør inkubator eller et vandbad? Hvilken udviklingsfase skal anvendes? Desværre, de metoder, der anvendes til at undersøge HSR varierer meget fra laboratorium til laboratorium, forårsager forvirring, når du vælger de bedste metoder og gør det vanskeligt at sammenligne resultater på tværs af feltet.
Vi præsenterer robuste og standardiserede protokoller for brug af RT-qPCR, fluorescerende journalister, og thermorecovery at måle HSR. Mens disse tre tilgange er komplementære, de hver især har unikke fordele og ulemper. For eksempel er RT-qPCR den mest direkte og kvantitative måling af HSR, og denne analyse kan let udvides til at omfatte mange forskellige varmechok-inducerende gener. Men RT-qPCR er den dyreste, kan være teknisk vanskeligt, og kræver brug af specialiseret udstyr. I modsætning hertil har fluorescerende journalister den fordel at måle vævsspecifikke forskelle i HSR induktion. Men de er vanskelige at kvantificere præcist, kan kun måle induktion over en vis tærskel, og kræver brug af en fluorescens mikroskop. Derudover er de reporter stammer, der er beskrevet her, udviklingsmæssigt forsinket i forhold til standard N2-stammen. Selv om nyere reporter stammer, der indeholder enkelt-kopi transgener er tilgængelige, er de ikke blevet testet her9. Den tredje analyse, thermorecovery, har den fordel, at den giver en fysiologisk relevant udlæsning på organismeniveau. Men denne analyse er velsagtens den mindst følsomme og mest indirekte. Endelig diskuterer vi nogle fælles variationer, der findes i disse analyser, og foreslår en række bedste praksis for at lette forskningen på dette område.
I litteraturen er en bred vifte af temperaturer, tider og udstyr blevet brugt til at analysere HSR, som har indført unødvendige forbehold og ført til vanskeligheder med at sammenligne resultater mellem laboratorier. For eksempel, temperaturer spænder overalt fra 32-37 °C og gange fra 15 min til flere timer er blevet brugt til at fremkalde HSR15. Det forlyder dog, at dødeligheden forekommer så tidligt som 3 timer ved 37 °C for alle stadier og 1,5 timer for dag 1 voksne15. Desuden viser vi, at eksponering af orme til 35 °C forårsager dødelighed, der ikke er HSF-1 afhængige, hvilket gør disse betingelser dårligt egnet til analyse af HSR. I modsætning hertil er et varmechok på 33 °C i 1 time robust nok til at fremkalde stærk induktion af varmechokgener, men mildt nok til ikke at påvirke ormens levedygtighed. Faktisk, eksponering for 33 °C, så længe 6 h kun forårsager 20% af orme til at vise unormal bevægelse. Derfor foreslår vi at bruge en temperatur på 33 °C og en tid på 1 time som en standardiseret tilstand for RT-qPCR og fluorescerende reporter assays.
Nylige forsøg har vist, at udviklingsmæssige iscenesættelse af orme for HSR eksperimenter er særlig vigtig. Det blev for nylig vist, at i C. elegans den inducerende HSR falder (dvs. kollapser) med >50%, når hermafroditter begynder æglægning5. Iscenesættelse ormene korrekt er kritisk, fordi der ofte er forskelle i udviklingsmæssige timing i stammer transporterer mutationer. Hvis der anvendes temperaturfølsomme mutanter, vil det også påvirke resultaterne, hvis de ikke synkroniseres efter deres fødealder. Derfor anbefales det omhyggeligt at måle starten af æglægning for hver stamme for at afgøre, hvornår sammenbruddet opstår. Tidens vindue efter L4 molt og før påbegyndelse af reproduktiv modenhed er smal; Der skal derfor udvises forsigtighed, så HSR-kollapset ikke utilsigtet forårsager variabilitet i resultaterne.
Ud over udviklingsmæssige timing, overraskende små ændringer i temperaturen, så lidt som 1 °C, kan have betydelige virkninger på HSR. For eksempel er termosensoriske neuroner i C. elegans følsomme over for temperaturændringer så små som ±0,05 °C16. Derfor er det bydende nødvendigt at bruge et termometer, der præcist kan måle temperaturen. Derfor foreslår vi som bedste praksis brugen af en kalibreret anordning til temperaturmåling, der er præcis nok til at måle temperaturer inden for ±0,1 °C. Desuden bør et termometer med datalogningsfunktion anvendes til at måle temperaturvariationer over tid. Mange væksthuse er specificeret til at have termiske variationer på mere end 1 °C i forskellige dele af inkubatoren og på tværs af tid, hvilket kan have betydelige virkninger på HSR-eksperimenter. Som en bedste praksis foreslår vi at bruge væksthuse, der har tilstrækkelig isolering og cirkulation til at minimere temperaturudsving. For at gennemføre varmechok eksperimenter, foreslår vi en bedste praksis for en cirkulerende vandbad. Den tid, det tager for en agarplade at nå en ønsket temperatur er ca. 6-7 min i et vandbad, men meget længere i en tør inkubator15,17. Men hvis en cirkulerende vandbad ikke er tilgængelig, har vi vist, at robust HSR induktion også forekommer i en tør inkubator ved hjælp af vores betingelser. Hvis der anvendes en tør inkubator, skal inkubatorens åbning under hele belastningen minimeres.
Det er veletableret, at induktion af varmechok gener er afhængig af master regulator af HSR, HSF-1. Her fremlægger vi beviser for, at de to mere indirekte analyser, fluorescerende journalister og thermorecovery, er også afhængige af HSF-1. Betydeligt, fandt vi, at en almindeligt anvendt alternativ organismeanalyse, thermotolerance, er ikke HSF-1 afhængig ved hjælp af hsf-1 RNAi (Figur 4). Lignende resultater er tidligere blevet rapporteret ved hjælp af en hsf-1 mutant eller en ttx-3 mutant, som blokerer HSR18,,19,20. Tilsammen tyder disse resultater på, at termostanceanalysen ikke bør anvendes til HSR-forskning. Desuden tyder dette på, at en bedste praksis er at teste HSF-1 afhængighed for enhver analyse, der anvendes til at måle HSR.
Samlet set præsenterer vi en række standardiserede protokoller og bedste praksis for robust og reproducerbar måling af HSR induktion i C. elegans. Vi håber, at disse metoder vil mindske variabiliteten i HSR-eksperimenter og øge reproducerbarheden. Fremme af direkte sammenligninger af HSR-forskning mellem laboratorier vil bidrage til at fremskynde forskningen på HSR-området. Desuden vil standardisering gavne forskning i aldring og neurodegenerative sygdomme, som HSR er tæt forbundet med.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en donation fra Frank Leslie. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |