Vi beskriver detaljerade protokoll för att använda FLLIT, en helt automatiserad maskininlärningsmetod för benklo rörelse spårning i fritt rörliga Drosophila melanogaster och andra insekter. Dessa protokoll kan användas för att kvantitativt mäta subtila gångrörelser i vilda typflugor, muterade flugor och flugamodeller av neurodegeneration.
Drosophila-modellen har varit ovärderlig för studier av neurologisk funktion och för att förstå de molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund för neurodegeneration. Medan flyga tekniker för manipulation och studier av neuronala undergrupper har blivit alltmer sofistikerade, har rikedomen i de resulterande beteendefenotyper inte fångats på en liknande detalj. För att kunna studera subtila fly benrörelser för jämförelse mellan mutanter kräver förmågan att automatiskt mäta och kvantifiera snabba och snabba benrörelser. Därför utvecklade vi en maskininlärningsalgoritm för automatiserad benklospårning i fritt gångflugor, Feature Learning-based Limb segmentation and Tracking (FLLIT). Till skillnad från de flesta djupinlärningsmetoder är FLLIT helt automatiserat och genererar sina egna träningsuppsättningar utan att behöva använda sig av användarinteckningar, med hjälp av morfologiska parametrar som är inbyggda i inlärningsalgoritmen. I den här artikeln beskrivs ett djupgående protokoll för att utföra gånganalys med FLLIT. Den beskriver förfarandena för kamera setup, arena konstruktion, videoinspelning, ben segmentering och ben klo spårning. Det ger också en översikt över de data som produceras av FLLIT, som inkluderar rå spåras kropp och ben positioner i varje video ram, 20 gång parametrar, 5 tomter och en spårad video. För att demonstrera användningen av FLLIT kvantifierar vi relevanta sjuka gångparametrar i en flugamodell av Spinocerebellar ataxi 3.
Under de senaste decennierna har neurodegenerativa sjukdomar och rörelsestörningar blivit vanligare i våra åldrande populationer. Även om vår förståelse av många neurodegenerativa sjukdomar har avancerat på molekylär och cellulär nivå, grundläggande funktioner i de drabbade neuronala kretsar underliggande sjukdomen fortfarande dåligt förstås. Nyligen utvecklade beteendemässiga spårningsverktyg1,2,3,4 tillåter oss nu att studera rörelse avvikelser i djursjukdom modeller för att identifiera molekylära, cellulära och krets dysregulation underliggande sjukdom.
Molekylära vägar som är involverade i många neurodegenerativa sjukdomar bevaras i fruktflugan Drosophila melanogaster, och Drosophila sjukdomsmodeller har bidragit till att belysa grundläggande mekanismer som ligger till grund för neurodegeneration5,6. Vi visade nyligen att flyga modeller av Parkinsons sjukdom (PD) och Spinocerebellar ataxi 3 (SCA3) uppvisar distinkta, bevarade gång signaturer som liknar de av de respektive mänskliga sjukdomar1, visar att flugan modellen kan användas för att förstå krets mekanismer underliggande rörelse dysfunktion i specifika rörelsestörningar. De rika och ständigt växande arsenal av verktyg i flugan modell för riktad manipulation och visualisering av nervceller på den enda genen och encellig nivå7,8,9,10 gör flugan en idealisk modell en att sondera förhållandet mellan sjukdomen vägar, neuronala kretsar och beteendemässiga fenotypiska manifestation in vivo. För att möjliggöra exakt, automatiserad insektsgång analys, vi nyligen utvecklat en maskininlärningsmetod, Feature Ltjäna-baserade LImb segmentering och Tracking (FLLIT)1.
FLLIT består av en helt automatiserad flerstegsalgoritm som först segmenterar benpixlarna, som sedan används för att lokalisera och spåra motsvarande benklor. FLLIT använder en öka algoritm för segmentering, i motsats till djupinlärning algoritmer som används i senaste arbetet2,3. Det finns vissa likheter med faltning neurala nätverk i att för båda ramverken, funktionen utvinning sker automatiskt genom lärande faltningskärnor. Det första steget i FLLIT innebär att använda morfologiska operationer (kant och skeletonization) för att automatiskt generera positiva (pixlar på benen) och negativa (bakgrund eller pixlar på flugkroppen) träningsprover med högt förtroende. Fllit är därför helt automatiserat och kräver inte användarkompederade utbildningsprover. Med hjälp av ovanstående träningsprover tränas en klassificerare sedan inom ramen för en ökande algoritm. En ensemble av svaga klassificerare är iterativt lärt, med varje bestående en uppsättning faltningskärnor för funktionen utvinning och ett beslut träd. Den slutliga learnt classifier används sedan för ben segmentering och kan bättre urskilja svåra regioner / hårda prover bättre än morfologiska operationer, vilket ger en övergripande mycket mer exakt segmentering för spårning1. Från de segmenterade benen hittar vi tipsen och spårar dem med den ungerska algoritmen: genom att matcha tips över ramar så att summan av avståndet som flyttas av varje spets minimeras. FLLIT kan hantera ocklusion fall genom att komma ihåg den senast sett plats (i flyga centrerad koordinater) så att ett ben spets återvinns när det inte längre är under ocklusion.
Vi visade tidigare att FLLIT automatiskt och exakt kan spåra benrörelser och analysera gång i en omärkt, fritt rörlig fluga eller spindel från höghastighetsvideo1; FLLIT bör därför i stort sett vara tillämpligt för benspårning av leddjur. Genom att extrahera maskininlärningsutbildningsuppsättningar med hjälp av morfologiska parametrar tränar FLLIT automatiskt sig själv för att segmentera och spåra insektsben utan behov av mödosam manuell anteckning, vilket krävs för de flesta djupinlärningsmetoder. FLLIT är därför helt automatiserad. Efter bensegmentering och spårning producerar FLLIT automatiskt råspårade kropps- och benpositioner i varje videoram, 20 gångparametrar, 5 ritordningar och en spårad video för gånganalys och visualisering av gångrörelser. Det här protokollet innehåller en steg-för-steg-guide för att använda FLLIT.
I detta manuskript beskriver vi i detalj de steg som ingår i att använda FLLIT, ett automatiserat maskininlärningsprogram1, för att analysera gång i fritt gående Drosophila. Efter spårning och dataanalys genererar FLLIT automatiskt rådata för positionsinformationen för kroppen och benklor, producerar tjugo kropp och gång funktioner samt en video av spårade flyga för att möjliggöra gångvisualisering.
Det finns nu ett antal metoder för ben rörelse spårning av Drosophila och andra djur1,2,3,4,,14,15,16, vilket ger forskarna ett brett utbud av alternativ beroende på målen för experimentet. Några av dessa är fotutskriftsbaserade metoder, som är mycket exakta men som endast rapporterar klo kontaktpunkter med detektionsytan4,14. Å andra sidan, senaste djupinlärning metoder2,3,16 är mycket mångsidig, vilket möjliggör analys av beteenden som kräver spårning av ben leder och andra kroppsdelar i alla djur, med förbehållet att algoritmerna måste först utbildas med användaren kommenterade datamängder. En tredje typ av metod använder morfologi eller bild-kontrast-baserade metoder1,15,17 för att hitta konturerna av varje ben för att identifiera klo positioner. I allmänhet behandlar dessa metoder dåligt beteenden där benen korsar över (t.ex. under grooming). FLLIT kombinerar den andra och tredje metoder, med hjälp av morfologiska parametrar för att träna en öka algoritm för ben segmentering. Detta gör fllit att kringgå den mödosamma uppgiften för användaren anteckning för att generera utbildning datauppsättning, samtidigt öka noggrannheten med hjälp av maskininlärning. Framtida förbättringar av FLLIT måste ta itu med fall där benen korsar över, för att möjliggöra analys av mer komplexa beteenden.
FLLIT är robust för små förändringar i belysning, inspelningsupplösning och ramhastighet1. Ramhastigheten för inspelade videor bör dock inte sjunka under 250 fps, och FLLIT körs optimalt för videor som spelats in med 1000 fps. Om det finns rörelseoskärpa i bilderna, så att det är utmanande för en mänsklig annotator att identifiera benet position, FLLIT kommer inte att kunna exakt identifiera ben tips i dessa ramar. Mot bakgrund av detta är det viktigt att kameran fokuseras kraftigt på benspetsarna. För att förhindra segmentering artefakter, bör arenan rengöras noggrant, och bör inte flyttas under inspelningen. För korrekt bakgrund subtraktion och ren segmentering, bör flugan flytta minst en kroppslängd under inspelningen, utan att pausa. Efter automatisk segmentering och spårning märkning av alla ben måste kontrolleras. Om fly-gången inte spåras eller spåras felaktigt ska filen spåras manuellt med alternativet Initiera spårning manuellt (steg 5.2.7 – 5.2.10).
Neurodegenerativa sjukdomar och rörelsestörningar blir allt vanligare i våra åldrande samhällen. Fly modeller av neurodegeneration har studerats i mer än 2 decennier, under vilka framsteg har gjorts när det gäller de molekylära och cellulära aspekterna av sjukdomen patofysiologi. Specifika beteendemässiga konsekvenser av sjukdomen har dock varit tekniskt svåra att bedöma. Till exempel, medan rapporter om darrande rörelser i flugan har gjorts18,19, hade dessa inte kvantitativt studerats förrän nyligen1. Klättringsanalysen har varit en användbar och kvantitativ, men relativt grov åtgärd6. Detta tekniska underskott har på liknande sätt hämmat analys av högupplösningsrörelser i andra djurmodeller. Tillkomsten av nya verktyg för beteendeanalys, därför har lovat att föryngra området rörelsestörningar för att forskare ska kunna studera hur molekylära och cellulära mekanismer för neuromuskulära sjukdomar leder till specifika beteendemässiga resultat i djurmodeller. I detta dokument och i vårt tidigare arbete1,visade vi med FLLIT att flyga modeller av SCA3 uppvisar en hyperkinetisk attaxa gång, medan PD flyga modeller uppvisar en hypokinetisk styv gång, recapitulating rörelse kännetecken för respektive mänskliga sjukdomar1. Gånganalys gjorde det också möjligt för oss att identifiera distinkta neuronala populationer bakom specifika rörelse dysfunktioner. Framöver, detaljerad rörelse analys, i kombination med kraftfulla bildframställning och funktionella verktyg som finns i farten, gör det möjligt för oss att få ny insikt i mekanismer för rörelsedysfunktion, belysa vår förståelse av neurodegenerativa sjukdomar med avseende på kretsmekanismer.
FLLIT bör vara allmänt tillämplig på studiegång i andra små leddjur, eftersom det tidigare visat sig vara mycket exakt för spårning av spindelbensrörelser1. Medan vi fokuserar här på användningen av detaljerad rörelse fenotypning för att kvantifiera patogena gång och dess underliggande kretsar, framsteg i rörelse spårning har redan revolutionerat, och kommer att ha fortsatt inverkan på, förståelsen av normal gång samordning och gång och dess underliggande kretsar, särskilt i otaliga olika grenar av det evolutionära trädet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Moumita Chatterjee och Alice Liu för tekniskt stöd, och Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana, USA) för att göra tillgängliga Drosophila stammar som används i detta arbete. Detta arbete stöddes av Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore; Bioinformatics Institute, Singapore; Byrån för vetenskapsteknik och forskningssambandsorganisation (anslag nr 15302FG149 till SA och LC). Det kliniska forskningsflaggprogrammet (Parkinsons sjukdom) som administreras av Singapore Ministry of Health’s National Medical Research Council (bidragsnummer NMRC/TCR/013-NNI/2014 till SA), University of Alberta (startbidrag till LC) och Science Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant (bidragsnummer RGPIN-2019-04575 till LC).
Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
Infra Red LED | Any – Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |