Vi beskriver detaljerte protokoller for bruk av FLLIT, en helautomatisk maskinlæringsmetode for benklobevegelsessporing i fritt bevegelige Drosophila melanogaster og andre insekter. Disse protokollene kan brukes til å kvantitativt måle subtile gangbevegelser i villtypefluer, muterte fluer og flymodeller av neurodegenerasjon.
Drosophila-modellen har vært uvurderlig for studiet av nevrologisk funksjon og for å forstå molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for nevrodegenerasjon. Mens fly teknikker for manipulering og studie av nevronale undergrupper har vokst stadig mer sofistikert, rikdommen av de resulterende atferdsfenotypene har ikke blitt fanget på en lignende detalj. For å kunne studere subtile fluebensbevegelser for sammenligning blant mutanter krever evnen til å automatisk måle og kvantifisere høyhastighets og raske benbevegelser. Derfor utviklet vi en maskinlæringsalgoritme for automatisert benklosporing i fritt gående fluer, Feature Learning-baserte Limb-segmentering og sporing (FLLIT). I motsetning til de fleste dype læringsmetoder, fllit er helautomatisk og genererer sine egne treningssett uten behov for brukermerknad, ved hjelp av morfologiske parametere innebygd i læringsalgoritmen. Denne artikkelen beskriver en grundig protokoll for å utføre ganganalyse ved hjelp av FLLIT. Den beskriver prosedyrene for kameraoppsett, arenabygging, videoopptak, bensegmentering og benklosporing. Det gir også en oversikt over dataene produsert av FLLIT, som inkluderer rå sporede kropps- og benposisjoner i hver videoramme, 20 gangartparametere, 5 tomter og en sporet video. For å demonstrere bruken av FLLIT kvantifiserer vi relevante syke gangartparametere i en flymodell av Spinocerebellar ataksi 3.
I de siste tiårene har nevrodegenerative sykdommer og bevegelsesforstyrrelser blitt mer utbredt i våre aldrende populasjoner. Selv om vår forståelse av mange nevrodegenerative sykdommer har avansert på molekylært og cellulært nivå, forblir grunnleggende trekk ved den berørte nevronale kretsen underliggende sykdommen dårlig forstått. Nylig utviklet atferdssporingsverktøy1,2,3,4 nå tillate oss å studere bevegelse snormiteter i dyresykdommodeller for å identifisere molekylær, cellulær og kretsdysregulering underliggende sykdom.
Molekylære veier involvert i mange nevrodegenerative sykdommer er bevart i fruktfluen Drosophila melanogaster, og Drosophila sykdommodeller har bidratt til å belyse grunnleggende mekanismer underliggende neurodegeneration5,6. Vi viste nylig at flymodeller av Parkinsons sykdom (PD) og Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) viser distinkte, bevarte gangartsignaturer som ligner de av de respektive menneskelige sykdommene1, som viser at flymodellen kan brukes til å forstå kretsmekanismer underliggende bevegelsesdysfunksjon i spesifikke bevegelsesforstyrrelser. Det rike og stadig voksende arsenalet av verktøy i flymodellen for målrettet manipulering og visualisering av nevroner på enkeltgenet og enkeltcellenivå7,,8,9,10 gjør flyet til en ideell modell for å undersøke forholdet mellom sykdomsveier, nevronale kretser og atferdsfenotypisk manifestasjon in vivo. For å muliggjøre presis, automatisert insektganganalyse utviklet vi nylig en maskinlæringsmetode, Feature Linntjeningsbasert LImb segmentering og Tracking (FLLIT)1.
FLLIT består av en helautomatisk flertrinnsalgoritme som først segmenterer benpikslene, som senere brukes til å finne og spore de tilsvarende benklørne. FLLIT benytter en økende algoritme for segmentering, i motsetning til dype læringsalgoritmer som brukes i nyere arbeid2,3. Det er noen likheter med convolutional nevrale nettverk i at for begge rammer, funksjonen utvinning gjøres automatisk gjennom læring convolutional kjerner. Det første trinnet i FLLIT innebærer å bruke morfologiske operasjoner (kant og skjelettisering) for å automatisk generere positive (piksler på beina) og negative (bakgrunn eller piksler på flykroppen) treningsprøver med høy tillit. FlLIT er derfor helautomatisk og krever ikke brukerkommenterte opplæringsprøver. Ved hjelp av de ovennevnte treningsprøvene blir en klassifikater deretter opplært innenfor rammen av en økende algoritme. Et ensemble av svake klassifikater er iterativt lært, med hver består av et sett med convolutional kjerner for funksjonen utvinning og et beslutningstre. Den endelige læreklassifisereren brukes deretter til bensegmentering og er i stand til å bedre skjelne vanskelige regioner / harde prøver bedre enn morfologiske operasjoner, noe som gir en samlet mye mer nøyaktig segmentering for sporing1. Fra de segmenterte beina finner vi tipsene og sporer dem ved hjelp av den ungarske algoritmen: ved å matche tips på tvers av rammer slik at summen av avstanden som flyttes av hvert tips minimeres. FLLIT kan håndtere okklusjonstilfeller ved å huske det siste sted (i fly sentrertkoordinater) slik at en benspiss gjenopprettes når det ikke lenger er under okklusjon.
Vi har tidligere vist at FLLIT kan automatisk og nøyaktig spore benbevegelser og analysere gangart i en umerket, fritt bevegelig fly eller edderkopp fra høyhastighets video1; FLLIT bør derfor være bredt anvendelig for leddyr ben sporing. Ved å trekke ut maskinlæringstreningssett ved hjelp av morfologiske parametere, trener FLLIT seg automatisk til å segmentere og spore insektben uten behov for arbeidskrevende manuell merknad, som kreves for de fleste dype læringsmetoder. FLLIT er dermed helautomatisk. Etter bensegmentering og sporing produserer FLLIT automatisk rå sporede kropps- og benposisjoner i hver videoramme, 20 gangartparametere, 5 tomter og en sporet video for ganganalyse og visualisering av gangbevegelser. Denne protokollen gir en trinnvis veiledning for bruk av FLLIT.
I dette manuskriptet beskriver vi i detalj trinnene som er involvert i bruk av FLLIT, et automatisert maskinlæringsprogram1,for å analysere gangart i fritt gående Drosophila. Etter sporing og dataanalyse genererer FLLIT automatisk rådata for posisjonsinformasjon fra kropp og benklør, som produserer tjue kropps- og gangfunksjoner samt en video av den sporede fluen for å muliggjøre gangartvisualisering.
Det finnes nå en rekke metoder for benbevegelsesporing av Drosophila og andre dyr1,2,3,4,14,15,16, noe som gir forskerne et bredt spekter av alternativer avhengig av målene for eksperimentet. Noen av disse er fotutskrift-baserte tilnærminger, som er svært nøyaktige, men som rapporterer bare klo kontaktpunkter med deteksjonsoverflaten4,14. På den annen side, nylig dyp læring tilnærminger2,3,16 er svært allsidig, slik at analyse av atferd som krever sporing av benledd og andre kroppsdeler i ethvert dyr, med forbehold om at algoritmene må først trenes med bruker kommenterte datasett. En tredje type tilnærming bruker morfologi eller bildekontrastbaserte metoder1,,15,17 for å finne omrisset av hvert ben for å identifisere kloposisjoner. Generelt handler disse metodene dårlig med atferd der beina krysser over (f.eks. under pleie). FLLIT kombinerer andre og tredje tilnærminger, ved hjelp av morfologiske parametere for å trene en økende algoritme for bensegmentering. Dette gjør det mulig for FLLIT å omgå den møysommelige oppgaven med brukermerknad for å generere opplæringsdatasettet, samtidig som nøyaktigheten forbedres ved hjelp av maskinlæring. Fremtidige forbedringer av FLLIT må håndtere tilfeller der beina krysser over, for å tillate analyse av mer kompleks atferd.
FLLIT er robust til små endringer i belysning, opptaksoppløsning og bildehastighet1. Rammehastigheten til innspilte videoer bør imidlertid ikke falle under 250 fps, og FLLIT kjører optimalt for videoer tatt opp med 1000 fps. Hvis det er bevegelsesuskarphet i bildene, slik at det er utfordrende for en menneskelig merknador å identifisere benposisjonen, vil FLLIT ikke kunne nøyaktig identifisere bentips i disse rammene. I lys av dette er det viktig at kameraet fokuseres kraftig på beinspissene. For å forhindre segmentering sartefakter, bør arenaen rengjøres grundig, og bør ikke flyttes under opptaket. For nøyaktig bakgrunnssubtraksjon og ren segmentering, bør flyet bevege seg minst én kroppslengde under opptaket, uten å sette den på pause. Etter automatisk segmentering og sporing må merkingen av alle beina kontrolleres. Hvis flygangarten ikke spores eller spores feil, bør filen spores manuelt ved hjelp av alternativet Start sporing manuelt (trinn 5.2.7 – 5.2.10).
Nevrodegenerative sykdommer og bevegelsesforstyrrelser blir stadig mer utbredt i våre aldrende samfunn. Fly modeller av neurodegeneration har blitt studert i mer enn 2 tiår, der fremskritt har blitt gjort om molekylære og cellulære aspekter av sykdom patofysiologi. Spesifikke atferdskonsekvenser av sykdom har imidlertid vært teknisk vanskelige å vurdere. For eksempel, mens rapporter om skjelvende bevegelser i fly har blitt gjort18,19, disse hadde ikke blitt kvantitativt studert før nylig1. Klatreanalysen har vært et nyttig og kvantitativt, men relativt grovt mål6. Dette tekniske underskuddet har på samme måte hindret høyoppløselig bevegelsesanalyse i andre dyremodeller. Bruk av nye verktøy for atferdsanalyse, derav, har lovet å forynge feltet av bevegelsesforstyrrelser for å gjøre det mulig for forskere å studere hvordan molekylære og cellulære mekanismer for nevromuskulære sykdommer fører til spesifikke atferdsresultater i dyremodeller. I dette papiret og i vårt tidligere arbeid1viste vi ved hjelp av FLLIT at flymodeller av SCA3 viser en hyperkinetisk ataksisk gangart, mens PD flymodeller viser en hypokinetisk stiv gangart, rekapitulerende bevegelseskjennetegn på de respektive menneskelige sykdommene1. Ganganalyse gjorde det også mulig for oss å identifisere forskjellige nevronale populasjoner underliggende spesifikke bevegelsesdysfunksjoner. Fremover vil detaljert bevegelsesanalyse, kombinert med de kraftige bildebehandlings- og funksjonelle verktøyene som er tilgjengelige i fluen, tillate oss å få ny innsikt i mekanismer for lokomotorisk dysfunksjon, og belyse vår forståelse av nevrodegenerative sykdommer med hensyn til kretsmekanismer.
FLLIT bør være allment anvendelig for å studere gangart i andre små leddyr, da det tidligere ble vist å være svært nøyaktig for sporing av edderkoppbenbevegelser1. Mens vi fokuserer her på bruk av detaljert bevegelse fenotyping for kvantifisere patogen gangart og dens underliggende kretser, har fremskritt i bevegelsessporing allerede revolusjonert, og vil ha fortsatt innvirkning på, forståelsen av normal gangkoordinering og gangart og dens underliggende kretser, spesielt i utallige forskjellige grener av det evolusjonære treet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Moumita Chatterjee og Alice Liu for teknisk støtte, og Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana, USA) for å gjøre tilgjengelig drosophila stammer som brukes i dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore; Bioinformatikk instituttet, Singapore; Agency for Science Technology and Research Joint Council Organization (gi nummer 15302FG149 til SA og LC); Clinical Research Flagship Programme (Parkinsons sykdom) administrert av Singapore Ministry of Health’s National Medical Research Council (gi nummer NMRC /TCR/013-NNI/2014 til SA), University of Alberta (oppstartsstipend til LC), og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant (gi nummer RGPIN-2019-04575 til LC).
Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
Infra Red LED | Any – Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |