हम फ्लिट का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, पैर पंजा आंदोलन ट्रैकिंग के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित मशीन लर्निंग विधि स्वतंत्र रूप से ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर और अन्य कीड़ों को चलती है। इन प्रोटोकॉल का उपयोग जंगली प्रकार की मक्खियों, उत्परिवर्ती मक्खियों और न्यूरोडिजेनरेशन के फ्लाई मॉडल में सूक्ष्म चलने वाले चाल आंदोलनों को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए किया जा सकता है।
ड्रोसोफिला मॉडल न्यूरोलॉजिकल फ़ंक्शन के अध्ययन के लिए और न्यूरोडिजेनरेशन को रेखांकित करने वाले आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने के लिए अमूल्य रहा है। जबकि हेरफेर और न्यूरोनल सबसेट के अध्ययन के लिए उड़ान भरने की तकनीक तेजी से परिष्कृत हो गई है, परिणामी व्यवहार फेनोटाइप की समृद्धि को समान विस्तार से नहीं पकड़ा गया है। म्यूटेंट के बीच तुलना के लिए सूक्ष्म फ्लाई लेग आंदोलनों का अध्ययन करने में सक्षम होने के लिए स्वचालित रूप से उच्च गति और तेजी से पैर आंदोलनों को मापने और निर्धारित करने की क्षमता की आवश्यकता होती है। इसलिए, हमने स्वतंत्र रूप से चलने वाली मक्खियों, सुविधा लर्निंग-आधारित अंग विभाजन और ट्रैकिंग (FLLIT) में स्वचालित लेग पंजा ट्रैकिंग के लिए एक मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम विकसित किया। सबसे गहरी सीखने के तरीकों के विपरीत, FLLIT पूरी तरह से स्वचालित है और सीखने के एल्गोरिदम में निर्मित रूपात्मक मापदंडों का उपयोग करके उपयोगकर्ता एनोटेशन की आवश्यकता के बिना अपने स्वयं के प्रशिक्षण सेट उत्पन्न करता है। यह लेख FLLIT का उपयोग कर चाल विश्लेषण करने के लिए एक गहराई प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह कैमरा सेटअप, अखाड़ा निर्माण, वीडियो रिकॉर्डिंग, पैर विभाजन और पैर पंजा ट्रैकिंग के लिए प्रक्रियाओं का विवरण । यह फ्लेट द्वारा उत्पादित डेटा का अवलोकन भी देता है, जिसमें हर वीडियो फ्रेम में रॉ ट्रैक किए गए बॉडी और लेग पोजिशन, 20 चाल पैरामीटर, 5 प्लॉट और एक ट्रैक किए गए वीडियो शामिल हैं । FLLIT के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हम स्पिनोसेरिबेलर एटैक्सिया 3 के फ्लाई मॉडल में प्रासंगिक रोगग्रस्त चाल मापदंडों की मात्रा निर्धारित करते हैं।
पिछले कुछ दशकों में, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग ों और आंदोलन विकारों हमारी उम्र बढ़ने की आबादी में अधिक प्रचलित हो गए हैं । हालांकि कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के बारे में हमारी समझ आणविक और सेलुलर स्तर पर उन्नत है, प्रभावित न्यूरोनल सर्किटरी अंतर्निहित रोग की मौलिक विशेषताएं खराब समझ में आती हैं। हाल ही में विकसित व्यवहार ट्रैकिंग उपकरण1,,2,,3,,4 अब हमें आणविक, सेलुलर और सर्किट डिस्रेगुलेशन अंतर्निहित बीमारी की पहचान करने के लिए पशु रोग मॉडल में आंदोलन असामान्यताओं का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं।
कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शामिल आणविक रास्तों को फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टरमें संरक्षित किया जाता है और ड्रोसोफिला रोग मॉडलों ने न्यूरोडिजेनरेशन5,6अंतर्निहित मौलिक तंत्रों को स्पष्ट करने में मदद की है । हमने हाल ही में दिखाया कि पार्किंसंस रोग (पीडी) और स्पिनोसेरिबेलर एटैक्सिया 3 (एससीए 3) के फ्लाई मॉडल अलग, संरक्षित चाल हस्ताक्षर प्रदर्शित करते हैं जो संबंधित मानव रोगों के समान होते हैं1,यह दर्शाता है कि फ्लाई मॉडल का उपयोग विशिष्ट आंदोलन विकारों में आंदोलन रोग अंतर्निहित सर्किट तंत्र को समझने के लिए किया जा सकता है। एकल,जीन और एकल कोशिका स्तर7,8,89,,10 पर न्यूरॉन्स के लक्षित हेरफेर और दृश्य के लिए फ्लाई मॉडल में उपकरणों के समृद्ध और लगातार बढ़ते शस्त्रागार फ्लाई को रोग के रास्तों, न्यूरोनल सर्किटरी और विवो में व्यवहार फेनोटाइपिक अभिव्यक्ति के बीच संबंधों की जांच करने के लिए एक आदर्श मॉडल बनाता है। सटीक, स्वचालित कीट चाल विश्लेषण को सक्षम करने के लिए, हमने हाल ही में एक मशीन लर्निंग विधि, एफखाने की एलकमाई आधारित लीएमबी सेगमेंटेशन और टीरैकिंग (FLLIT)1विकसित की है।
FLLIT में पूरी तरह से स्वचालित मल्टी-स्टेज एल्गोरिदम होता है जो पहले लेग पिक्सल को सेगमेंट करता है, जिसका उपयोग बाद में संबंधित पैर के पंजे का पता लगाने और ट्रैक करने के लिए किया जाता है। FLLIT हाल के काम2,,3में इस्तेमाल गहरे सीखने एल्गोरिदम के विपरीत, विभाजन के लिए एक बढ़ाने एल्गोरिथ्म को रोजगार देता है । वहां में है कि दोनों चौखटे के लिए में convolutional तंत्रिका नेटवर्क के साथ कुछ समानताएं हैं, सुविधा निष्कर्षण संवोर्तिविज्ञान गुठली सीखने के माध्यम से स्वचालित रूप से किया जाता है । FLLIT में पहले कदम में उच्च आत्मविश्वास के साथ स्वचालित रूप से सकारात्मक (पैरों पर पिक्सेल) और नकारात्मक (फ्लाई बॉडी पर पृष्ठभूमि या पिक्सल) प्रशिक्षण नमूने उत्पन्न करने के लिए रूपात्मक संचालन (एज और कंकालीकरण) का उपयोग करना शामिल है। इसलिए, FLLIT पूरी तरह से स्वचालित है और उपयोगकर्ता एनोटेटेड प्रशिक्षण नमूनों की आवश्यकता नहीं है। उपरोक्त प्रशिक्षण नमूनों का उपयोग करके, एक क्लासिफायर को बूस्टिंग एल्गोरिदम के ढांचे में प्रशिक्षित किया जाता है। कमजोर वर्गीकरण का एक पहनावा iteratively सीखा है, प्रत्येक सुविधा निष्कर्षण और एक निर्णय पेड़ के लिए convolutional गुठली का एक सेट मिलकर । अंतिम सीखा वर्गीकरण तो पैर विभाजन के लिए प्रयोग किया जाता है और बेहतर कठिन क्षेत्रों/कठिन नमूनों रूपात्मक आपरेशनों से बेहतर विचार करने में सक्षम है,1ट्रैकिंग के लिए एक समग्र बहुत अधिक सटीक विभाजन का उत्पादन । खंडित पैरों से, हम सुझावों का पता लगाते हैं और हंगरी एल्गोरिदम का उपयोग करके उन्हें ट्रैक करते हैं: फ्रेम में सुझावों का मिलान करके जैसे कि प्रत्येक टिप द्वारा स्थानांतरित दूरी का योग कम हो जाता है। FLLIT पिछले देखा स्थान (फ्लाई केंद्रित निर्देशांक में) याद करके occlusion मामलों को संभाल सकता है ताकि एक पैर टिप एक बार यह occlusion के तहत नहीं है बरामद किया जाता है ।
हमने पहले दिखाया था कि FLLIT स्वचालित रूप से और सटीक रूप से पैर आंदोलनों को ट्रैक कर सकता है और उच्च गति वाले वीडियो1से एक अचिह्नित, स्वतंत्र रूप से चलती फ्लाई या मकड़ी में चाल का विश्लेषण कर सकता है; इसलिए फ्ललिट मोटे तौर पर आर्थ्रोपॉड लेग ट्रैकिंग के लिए लागू होना चाहिए। रूपात्मक मापदंडों का उपयोग करके मशीन लर्निंग प्रशिक्षण सेट निकालकर, FLLIT स्वचालित रूप से श्रमसाध्य मैनुअल एनोटेशन की आवश्यकता के बिना कीट पैरों को खंड और ट्रैक करने के लिए स्वचालित रूप से प्रशिक्षित करता है, जो सबसे गहरे सीखने के तरीकों के लिए आवश्यक है। FLLIT इसलिए पूरी तरह से स्वचालित है। पैर विभाजन और ट्रैकिंग के बाद, FLLIT स्वचालित रूप से हर वीडियो फ्रेम, 20 चाल मापदंडों, 5 भूखंडों और चाल विश्लेषण और चाल आंदोलनों के दृश्य के लिए एक ट्रैक वीडियो में कच्चे ट्रैक शरीर और पैर की स्थिति का उत्पादन करता है । यह प्रोटोकॉल FLLIT का उपयोग करने के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करता है।
इस पांडुलिपि में, हम स्वतंत्र रूप से चलने वाले ड्रोसोफिलामें चाल का विश्लेषण करने के लिए, एक स्वचालित मशीन-लर्निंग प्रोग्राम1,FLLIT का उपयोग करने में शामिल चरणों का विस्तार से वर्णन करते हैं। ट्रैकिंग और डेटा विश्लेषण के बाद, FLLIT स्वचालित रूप से शरीर और पैर के पंजे की स्थितीय जानकारी के लिए कच्चे डेटा उत्पन्न करता है, बीस शरीर और चाल सुविधाओं के साथ-साथ ट्रैक फ्लाई का एक वीडियो उत्पन्न करता है ताकि चाल दृश्य को सक्षम किया जा सके।
अब ड्रोसोफिला और अन्य जानवरों की लेग मूवमेंट ट्रैकिंग के लिए कई,तरीके हैं1,,2,3,34,414,,15,,16,शोधकर्ताओं को प्रयोग के लक्ष्यों के आधार पर विकल्पों की एक विस्तृत श्रृंखला दे रही है। इनमें से कुछ पैर मुद्रण आधारित दृष्टिकोण हैं, जो अत्यधिक सटीक हैं, लेकिन जो पता लगाने की सतह4,,14के साथ केवल पंजा संपर्क बिंदुओं की रिपोर्ट करते हैं। दूसरी ओर, हाल ही में गहरी सीखने के दृष्टिकोण2,,3,,16 अत्यधिक बहुमुखी हैं, व्यवहार है कि किसी भी जानवर में पैर जोड़ों और अंय शरीर के अंगों की ट्रैकिंग की आवश्यकता के विश्लेषण की अनुमति, चेतावनी के साथ कि एल्गोरिदम पहले उपयोगकर्ता एनोटेटेड डेटासेट के साथ प्रशिक्षित किया जाना चाहिए । एक तीसरा प्रकार का दृष्टिकोण पंजों की स्थिति की पहचान करने के लिए प्रत्येक चरण की रूपरेखा खोजने के लिए आकृति विज्ञान या छवि-विपरीत आधारित तरीकों का उपयोग करताहै 1,,15,,17। सामान्य तौर पर, ये विधियां उन व्यवहारों के साथ खराब होती हैं जहां पैर पार करते हैं (उदाहरण के लिए ग्रूमिंग के दौरान)। FLLIT पैर विभाजन के लिए एक बढ़ाने एल्गोरिथ्म को प्रशिक्षित करने के लिए रूपात्मक मापदंडों का उपयोग करते हुए दूसरे और तीसरे दृष्टिकोण को जोड़ती है। यह FLLIT को मशीन लर्निंग का उपयोग करसटीकता बढ़ाने के दौरान प्रशिक्षण डेटासेट उत्पन्न करने के लिए उपयोगकर्ता एनोटेशन के श्रमसाध्य कार्य को बाईपास करने की अनुमति देता है। FLLIT के लिए भविष्य में सुधार के लिए उदाहरण है जहां पैर पार से निपटने के लिए, और अधिक जटिल व्यवहार के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए होगा ।
FLLIT रोशनी, रिकॉर्डिंग रिज़ॉल्यूशन और फ्रेम स्पीड1में मामूली बदलावों के लिए मजबूत है। हालांकि, रिकॉर्ड किए गए वीडियो की फ्रेम गति 250 एफपीएस से नीचे नहीं गिरनी चाहिए, और FLLIT 1000 एफपीएस पर रिकॉर्ड किए गए वीडियो के लिए बेहतर ढंग से चलता है। यदि छवियों में गति धुंधला है, जैसे कि पैर की स्थिति की पहचान करना मानव एनोटेटर के लिए चुनौतीपूर्ण है, तो FLLIT उन फ्रेम में पैर के सुझावों की सही पहचान करने में सक्षम नहीं होगा। इसकी रोशनी में जरूरी है कि कैमरे को लेग टिप्स पर तेजी से फोकस किया जाए। विभाजन कलाकृतियों को रोकने के लिए, क्षेत्र को अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए, और रिकॉर्डिंग के दौरान स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए। सटीक पृष्ठभूमि घटाव और साफ विभाजन के लिए, फ्लाई को रिकॉर्डिंग के दौरान कम से कम एक शरीर की लंबाई को स्थानांतरित करना चाहिए, बिना रुके। स्वचालित विभाजन और ट्रैकिंग के बाद सभी पैरों की लेबलिंग की जांच की जानी चाहिए। यदि फ्लाई चाल को गलत तरीके से ट्रैक या ट्रैक नहीं किया जाता है, तो फ़ाइल को मैन्युअल रूप से शुरू ट्रैकिंग विकल्प (चरण 5.2.7 – 5.2.10) का उपयोग करके मैन्युअल रूप से फिर से ट्रैक किया जाना चाहिए।
न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग और आंदोलन विकार हमारे बुढ़ापे समाजों में तेजी से प्रचलित हैं। न्यूरोडिजेनरेशन के फ्लाई मॉडल का अध्ययन 2 दशकों से अधिक समय से किया गया है, जिसके दौरान रोग रोग विज्ञान के आणविक और सेलुलर पहलुओं के बारे में प्रगति की गई है। हालांकि, रोग के विशिष्ट व्यवहार परिणामतकनीकी रूप से आकलन करना मुश्किल हो गया है। उदाहरण के लिए, जबकि मक्खी में कांपने वाली हरकतों की रिपोर्ट18,,19कर दी गई है, हाल ही में1तक इनका मात्रात्मक अध्ययन नहीं किया गया था । चढ़ाई परख एक उपयोगी और मात्रात्मक, अभी तक अपेक्षाकृत मोटे उपाय6किया गया है । इस तकनीकी घाटे ने इसी तरह अन्य पशु मॉडलों में उच्च संकल्प आंदोलन विश्लेषण को बाधित किया है । व्यवहार विश्लेषण के लिए नए उपकरणों के आगमन, इसलिए, आंदोलन विकारों के क्षेत्र को फिर से जीवंत करने का वादा किया है शोधकर्ताओं को अध्ययन करने के लिए कैसे आणविक और न्यूरोमस्कुलर रोगों के सेलुलर तंत्र पशु मॉडल में विशिष्ट व्यवहार परिणाम के लिए नेतृत्व करने के लिए सक्षम है । इस पेपर में और हमारे पिछले काम1में, हमने फ्लिलिट का उपयोग करके दिखाया जो एससीए 3 के फ्लाई मॉडल एक हाइपरकाइनेटिक अकरिक चाल प्रदर्शित करते हैं, जबकि पीडी फ्लाई मॉडल संबंधित मानव रोगों की एक हाइपोकाइनेटिक कठोर चाल, संक्षिप्त आंदोलन की पहचान प्रदर्शित करतेहैं। चाल विश्लेषण ने हमें विशिष्ट आंदोलन के रोगों में अंतर्निहित विशिष्ट न्यूरोनल आबादी की पहचान करने में भी सक्षम बनाया। आगे जा रहे हैं, विस्तृत आंदोलन विश्लेषण, शक्तिशाली इमेजिंग और कार्यात्मक मक्खी में उपलब्ध उपकरणों के साथ संयुक्त, हमें लोकोमोटर रोग के तंत्र में उपंयास अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति देगा, सर्किट तंत्र के संबंध में न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के बारे में हमारी समझ रोशन ।
FLLIT अन्य छोटे आर्थ्रोपोड में चाल का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से लागू होना चाहिए, क्योंकि यह पहले मकड़ी पैर आंदोलनों पर नज़र रखने के लिए अत्यधिक सटीक होने का प्रदर्शन किया गया था1. जब तक हम रोगजनक चाल और उसके अंतर्निहित सर्किटरी की मात्रा के लिए विस्तृत आंदोलन फेनोटाइपिंग के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं, तो आंदोलन ट्रैकिंग में प्रगति ने पहले ही क्रांति ला दी है, और सामान्य चलने वाले समन्वय और चाल और उसके अंतर्निहित सर्किट की समझ, विशेष रूप से विकासवादी पेड़ की असंख्य विभिन्न शाखाओं में इसपर प्रभाव डालना जारी रखेगा।
The authors have nothing to disclose.
लेखक तकनीकी सहायता के लिए मौमिता चटर्जी और एलिस लियू और ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (इंडियाना, यूएसए) को इस काम में इस्तेमाल होने वाले ड्रोसोफिला उपभेदों को उपलब्ध कराने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को इंस्टीट्यूट ऑफ मॉलिक्यूलर एंड सेल बायोलॉजी, सिंगापुर द्वारा समर्थित किया गया था; बायोइन्फॉर्मेटिक्स इंस्टीट्यूट, सिंगापुर; विज्ञान प्रौद्योगिकी और अनुसंधान संयुक्त परिषद संगठन के लिए एजेंसी (एसए और एलसी को अनुदान संख्या 15302FG149); सिंगापुर स्वास्थ्य मंत्रालय की राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (अनुदान संख्या एनएमआरसी/टीसीआर/013-एनएनआई/2014 एसए), अलबर्टा विश्वविद्यालय (एलसी को स्टार्टअप ग्रांट), और कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) डिस्कवरी ग्रांट (अनुदान संख्या आरजीपिन-2019-04575 को एलसी) द्वारा प्रशासित नैदानिक अनुसंधान प्रमुख कार्यक्रम (पार्किंसंस रोग) ।
Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
Infra Red LED | Any – Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |