Vi beskriver detaljerede protokoller for brug af FLLIT, en fuldautomatisk maskine llære metode til ben klo bevægelse sporing i frit at flytte Drosophila melanogaster og andre insekter. Disse protokoller kan bruges til kvantitativt at måle subtile gangart bevægelser i vilde type fluer, mutant fluer og flyve modeller af neurodegeneration.
Drosophila-modellen har været uvurderlig for studiet af neurologisk funktion og for forståelsen af de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for neurodegeneration. Mens flyve teknikker til manipulation og undersøgelse af neuronal delmængder er vokset stadig mere sofistikeret, den rigdom af de resulterende adfærdsmæssige fænotyper er ikke blevet fanget på en lignende detalje. For at kunne studere subtile fluebenbevægelser til sammenligning blandt mutanter kræver evnen til automatisk at måle og kvantificere højhastigheds- og hurtige benbevægelser. Derfor har vi udviklet en machine-learning algoritme til automatiseret ben klo sporing i frit gående fluer, Feature Learning-baserede Limb segmentering og Tracking (FLLIT). I modsætning til de fleste deep learning-metoder er FLLIT fuldt automatiseret og genererer sine egne træningssæt uden behov for brugeranmærkning ved hjælp af morfologiske parametre, der er indbygget i læringsalgoritmen. I denne artikel beskrives en dybdegående protokol til udførelse af ganganalyse ved hjælp af FLLIT. Det beskriver procedurerne for kamera opsætning, arena konstruktion, videooptagelse, ben segmentering og ben klo sporing. Det giver også et overblik over de data, der produceres af FLLIT, som omfatter rå sporede krop og ben positioner i hver video ramme, 20 gangart parametre, 5 parceller og en sporet video. For at demonstrere brugen af FLLIT kvantificerer vi relevante syge gangartparametre i en fluemodel af Spinocerebellar ataksi 3.
I de sidste par årtier, neurodegenerative sygdomme og bevægelsesforstyrrelser er vokset mere udbredt i vores aldrende befolkninger. Selv om vores forståelse af mange neurodegenerative sygdomme har udviklet sig på det molekylære og cellulære niveau, grundlæggende elementer i de berørte neuronal kredsløb underliggende sygdom forbliver dårligt forstået. Nyligt udviklede adfærdsmæssige tracking værktøjer1,2,,3,,4 nu giver os mulighed for at studere bevægelse abnormiteter i dyresygdomme modeller med henblik på at identificere molekylære, cellulære og kredsløb dysregulering underliggende sygdom.
Molekylære veje, der er involveret i mange neurodegenerative sygdomme, bevares i frugtfluen Drosophila melanogaster, og Drosophila-sygdomsmodeller har bidraget til at belyse grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for neurodegeneration5,6. Vi har for nylig viste, at flyve modeller af Parkinsons sygdom (PD) og Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) udviser forskellige, bevarede gangart signaturer, der ligner de respektive menneskelige sygdomme1, viser, at flyve model kan bruges til at forstå kredsløb mekanismer underliggende bevægelse dysfunktion i specifikke bevægelsesforstyrrelser. Den rige og konstant voksende arsenal af værktøjer i flyve model for målrettet manipulation og visualisering af neuroner på enkelt gen og enkelt celle niveau7,,8,,9,,10 gør fluen en ideel model en til at sonde forholdet mellem sygdomsveje, neuronal kredsløb og adfærdsmæssige fænotypiske manifestation in vivo. For at muliggøre præcis, automatiseret insekt gangart analyse, vi for nylig udviklet en machine learning metode, Feature Ltjener-baserede LImb segmentering og Treoler (FLLIT)1.
FLLIT består af en fuldautomatisk flertrinsalgoritme, der først segmenterer benpixel, som efterfølgende bruges til at lokalisere og spore de tilsvarende benkløer. FLLIT anvender en forstærkende algoritme til segmentering i modsætning til deep learning algoritmer, der anvendes i det seneste arbejde2,3. Der er nogle ligheder med convolutional neurale netværk i, at for begge rammer, funktion udvinding sker automatisk gennem læring convolutional kerner. Det første skridt i FLLIT indebærer brug af morfologiske operationer (kant og skeletonisering) til automatisk at generere positive (pixels på benene) og negative (baggrund eller pixels på fluekroppen) uddannelse prøver med høj sikkerhed. Fllit er derfor fuldautomatisk og kræver ikke brugerkommenterede træningsprøver. Ved hjælp af ovenstående træningsprøver trænes en klassificering derefter inden for rammerne af en forstærkende algoritme. Et ensemble af svage klassificeringer er iterativt lært, med hver bestående af et sæt af convolutional kerner til funktionen udvinding og en beslutning træ. Den endelige lærte klassificering bruges derefter til bensegmentering og er i stand til bedre at skelne vanskelige regioner / hårde prøver bedre end morfologiske operationer, der producerer en samlet langt mere præcis segmentering til sporing1. Fra de segmenterede ben finder vi spidserne og sporer dem ved hjælp af den ungarske algoritme: ved at matche tips på tværs af rammer, således at summen af den afstand, der flyttes af hver spids, minimeres. FLLIT kan håndtere okklusion tilfælde ved at huske den sidst sete placering (i flyve centreret koordinater), således at et ben spids er inddrevet, når det ikke længere er under okklusion.
Vi har tidligere vist, at FLLIT automatisk og præcist kan spore benbevægelser og analysere gangart i en umærket, frit bevægende flyve eller edderkop fra high-speed video1; FLLIT bør derfor være bredt anvendelig for leddyr ben sporing. Ved at udtrække maskinlæringstræningssæt ved hjælp af morfologiske parametre træner FLLIT automatisk sig selv til at segmentere og spore insektben uden behov for besværlig manuel anmærkning, hvilket er nødvendigt for de fleste deep learning-metoder. FLLIT er derfor fuldt automatiseret. Efter ben segmentering og sporing, FLLIT automatisk producerer rå sporede krop og ben positioner i hver video ramme, 20 gangart parametre, 5 parceller og en sporet video til gangart analyse og visualisering af gangart bevægelser. Denne protokol indeholder en trinvis vejledning til brug af FLLIT.
I dette manuskript beskriver vi i detaljer de trin, der er involveret i at bruge FLLIT, en automatiseret machine-learning program1, at analysere gangart i frit gå Drosophila. Efter sporing og dataanalyse genererer FLLIT automatisk rådata til positionsoplysninger om krops- og benkløer, der producerer tyve krops- og gangartfunktioner samt en video af den sporede flue for at muliggøre gangvisualisering.
Der er nu en række metoder til ben bevægelse sporing af Drosophila og andre dyr1,2,3,4,,14,15,16, giver forskerne en bred vifte af muligheder afhængigt af målene for forsøget. Nogle af disse er fodprint-baserede tilgange, som er meget præcise, men som rapporterer kun klo kontaktpunkter med detektionsoverfladen4,14. På den anden side, de seneste deep learning tilgange2,3,16 er meget alsidige, så analyse af adfærd, der kræver sporing af benled og andre kropsdele i ethvert dyr, med det forbehold, at algoritmerne skal først trænes med brugeren kommenterede datasæt. En tredje type tilgang bruger morfologi eller billedkontrastbaserede metoder1,15,17 til at finde konturen af hvert ben til at identificere klopositioner. Generelt handler disse metoder dårligt om adfærd, hvor benene krydser over (f.eks. under grooming). FLLIT kombinerer den anden og tredje tilgang ved hjælp af morfologiske parametre til at træne en forstærkende algoritme til bensegmentering. Dette gør det muligt for FLLIT at omgå den møjsommelige opgave brugeranmærkning til at generere træningsdatasættet, samtidig med at nøjagtigheden ved hjælp af machine learning forbedres. Fremtidige forbedringer af FLLIT bliver nødt til at beskæftige sig med tilfælde, hvor benene krydser over, at give mulighed for analyse af mere komplekse adfærd.
FLLIT er robust til mindre ændringer i belysning, optagelsesopløsning og rammehastighed1. Dog bør frame hastighed optagede videoer ikke falder til under 250 fps, og FLLIT kører optimalt for videoer optaget på 1000 fps. Hvis der er bevægelsesløring i billederne, så det er en udfordring for en menneskelig anmærkningsator at identificere benpositionen, vil FLLIT ikke være i stand til præcist at identificere benspidser i disse rammer. I lyset af dette er det vigtigt, at kameraet fokuseres skarpt på benspidserne. For at forhindre segmentering artefakter, skal arenaen rengøres grundigt, og bør ikke flyttes under optagelsen. For nøjagtig baggrundssubtraktion og ren segmentering skal fluen bevæge sig mindst én kropslængde under optagelsen uden at holde pause. Efter automatisk segmentering og sporing skal mærkningen af alle benene kontrolleres. Hvis fluegangden ikke spores eller spores forkert, skal filen spores manuelt ved hjælp af indstillingen Inituer sporing manuelt (trin 5.2.7 – 5.2.10).
Neurodegenerative sygdomme og bevægelsesforstyrrelser er i stigende grad udbredt i vores aldrende samfund. Flyve modeller af neurodegeneration er blevet undersøgt i mere end 2 årtier, hvor der er gjort fremskridt med hensyn til de molekylære og cellulære aspekter af sygdomspatofysiologi. Men, specifikke adfærdsmæssige konsekvenser af sygdom har været teknisk vanskeligt at vurdere. For eksempel, mens rapporter om rystende bevægelser i fluen er blevet gjort18,19, disse var ikke blevet kvantitativt undersøgt indtil for nylig1. Klatreanalysen har været en nyttig og kvantitativ, men relativt grov foranstaltning6. Dette tekniske underskud har ligeledes hæmmet analysen af højopløsningsbevægelser i andre dyremodeller. Fremkomsten af nye værktøjer til adfærdsanalyse, derfor, har lovet at forynge inden for bevægelsesforstyrrelser at gøre det muligt for forskere at undersøge, hvordan molekylære og cellulære mekanismer af neuromuskulære sygdomme føre til specifikke adfærdsmæssige resultater i dyremodeller. I dette papir og i vores tidligere arbejde1, viste vi ved hjælp af FLLIT at flyve modeller af SCA3 udviser en hyperkinetisk ataksisk gangart, mens PD flyve modeller udviser en hypokinetisk stiv gangart, opsummerer bevægelse kendetegnende for de respektive menneskelige sygdomme1. Gait analyse også gjort det muligt for os at identificere forskellige neuronal populationer underliggende specifikke bevægelse dysfunktioner. Fremadrettet vil detaljeret bevægelsesanalyse kombineret med de kraftfulde billedbehandlings- og funktionsværktøjer, der er tilgængelige i fluen, give os mulighed for at få ny indsigt i mekanismer for bevægelsesdysfunktion, der oplyser vores forståelse af neurodegenerative sygdomme med hensyn til kredsløbsmekanismer.
FLLIT bør være almindeligt anvendelig til at studere gangart i andre små leddyr, da det tidligere blev påvist at være meget præcis til sporing af edderkoppebensbevægelser1. Mens vi fokuserer her på brugen af detaljerede bevægelse fænotypebestemmelse til kvantificering af patogen gangart og dens underliggende kredsløb, fremskridt i bevægelse sporing har allerede revolutioneret, og vil have fortsat indflydelse på, forståelsen af normal gangkoordinering og gangart og dens underliggende kredsløb, især i utallige forskellige grene af det evolutionære træ.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Moumita Chatterjee og Alice Liu for teknisk support, og Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana, USA) for at stille drosophila stammer, der anvendes i dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore; Bioinformatikinstituttet, Singapore; Organisationen for Det Fælles Råds Organisation for Videnskabsteknologi og Forskning (tilskudsnummer 15302FG149 til SA og LC) det flagskibsprogram for klinisk forskning (Parkinsons sygdom), der administreres af SingaporeS sundhedsministeriums Nationale Medicinske Forskningsråd (tilskudsnummer NMRC/TCR/013-NNI/2014 til SA), University of Alberta (opstartstilskud til LC) og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant (tilskudsnummer RGPIN-2019-04575 til LC).
Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
Infra Red LED | Any – Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |