Surexpression rétrovirale de CXCR4 sur les cellules murine B-1a et transfert adoptif pour la migration ciblée de cellules B-1a à la moelle osseuse et à la production d’IgM

Des études récentes ont démontré des cellules immunitaires considérables, et plus particulièrement la cellule B, l’hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle selon la localisation cellulaire^1,2,3,4,5. Les cellules B-1a sont l’une de ces populations avec la capacité hétérogène de produire des anticorps protecteurs d’IgM ; Les cellules de moelle osseuse B-1a sécrètent IgM de façon constitutive et contribuent de manière significative aux tituses plasmatiques IgM⁶, tandis que les cellules peritonéal B-1a ont la sécrétion IgM de bas niveau à l’homéostasie et peuvent plutôt être activées par le récepteur inné de type péage (TLR) ou la signalisation cytokine-négociée pour proliférer rapidement, migrer, et sécrétion IgM^7,8, 9^,9109. Les anticorps IgM à cellules B-1a reconnaissent les épitopes spécifiques à l’oxydation (OSE) qui sont présents sur les agents pathogènes, les cellules apoptotiques et le LDL oxydé, et la liaison IgM à l’OSE peut prévenir la signalisation inflammatoire en aval dans des maladies comme l’athérosclérose¹¹. Par conséquent, les stratégies visant à augmenter la production d’IgM par l’augmentation de la migration péritonéale de cellules B-1a vers des sites comme la moelle osseuse peuvent être thérapeutiquement utiles. Cependant, il est important que de telles stratégies soient ciblées et spécifiques de type cellulaire, car les effets hors cible peuvent avoir un impact négatif sur la fonction ou la santé immunitaires.

Ici, nous décrivons une méthode de surexpression ciblée et à long terme de CXCR4 dans les cellules B-1a murines primaires et le transfert adoptif subséquent pour visualiser la migration cellulaire et la production fonctionnelle d’anticorps IgM (figure 1). La manipulation génétique des cellules B primaires est limitée par une faible efficacité transfection par rapport à la transfection des lignées cellulaires transformées. Cependant, comme les lignées cellulaires transformées peuvent s’écarter considérablement des cellules primaires^12,13, l’utilisation de cellules primaires est susceptible de fournir des résultats qui s’alignent plus étroitement à la physiologie normale. Plusieurs techniques ont été décrites pour le transfert de gènes dans les cellules B murines primaires, y compris la transduction rétrovirale, la transduction adénovirale, la lipofection, ou la transfection basée sur l’électroporation, qui ont des niveaux variables d’efficacité, d’éphémère, et d’impact sur la santé cellulaire^13,14,15. La méthode suivante a utilisé la transduction rétrovirale car elle a donné une efficacité adéquate de transfert de gène de ‘gt;30% tout en ayant un impact minimal sur la viabilité cellulaire. Le rétrovirus CXCR4-exprimant a été généré à l’aide de la protéine fluorescente ribosomal-verte de la construction rétrovirale décrite précédemment par le virus des cellules souches murines (MSCV-IRES-GFP; MigR1)¹⁶, dans lequel la souris CXCR4 gène a été sous-cloné⁴. Les particules rétrovirales MigR1 (control(Ctl)-GFP) et CXCR4-GFP ont été générées à l’aide de la transfection de phosphate de calcium telle qu’elle a été décrite dans les protocoles^4,14précédemment publiés.

Les cellules de B-1a transdurées avec succès ont ensuite été transférées par voie intraveineuse dans^rag1-/- souris lymphocytes-déficientes. Les souris de donneur et de destinataire ont en outre contenu le knock-out du gène E (ApoE) d’apolipoprotein, qui a comme conséquence l’accumulation et l’athérosclérose accrues d’OSE, fournissant ainsi un modèle pour l’activation in vivo de cellules B-1 et la production d’IgM. En outre, les souris de donneur et de destinataire différaient dans l’allotype de CD45 ; Les cellules B-1 du donneur provenaient de CD45.1MD ApoE^-/- des souris et ont été transférées dans Rag1^-/- CD45.2 ApoE^-/- receveurs. Ceci a permis la différenciation du CD45.1 de donneur des cellules CD45.2 B destinataire après le transfert sans avoir besoin de tache en outre pour des marqueurs de cellules B pendant l’analyse de cytométrie d’écoulement. Les résultats fournis ici démontrent que la surexpression ciblée de CXCR4 sur les cellules de B-1a associe à la capacité accrue des cellules de B-1a de migrer vers la moelle osseuse, qui associe à l’augmentation de l’anti-OSE IgM plasmatique. Nous fournissons en outre une méthode pour l’enrichissement des cellules péritonéales B-1 par la sélection négative et démontrons l’exigence de l’activation de cellules B-1 pour la transduction efficace. Cette méthode peut être adaptée à d’autres constructions rétrovirales pour étudier l’effet de la surexpression des protéines sur la migration, le phénotype ou la fonction des cellules B-1a. En outre, l’utilisation de CD45.1 contre la distinction d’allotype de CD45.2 pourrait théoriquement permettre le transfert dans d’autres modèles murins immuno-suffisants contenant des cellules B endogènes.