Proteinlerin %80’inden fazlasının diğer moleküllerle etkileşimleri olduğu tahmin edilmektedir¹, bu da PPI’ların hücre^2’dekibelirli biyolojik fonksiyonların yürütülmesinde ne kadar önemli olduğunu vurgular. Bazı proteinler hücre sağkalım için gerekli olan büyük komplekslerin montajını kolaylaştıran hub’lar olarak işlev^{görürler 1.} Bu hub’lar birden çok PPI’ya aracılık eder ve proteinlerin hücre^3’tekibelirli işlevleri kolaylaştıran bir ağ halinde organize etmeye yardımcı olur. Protein komplekslerinin oluşumu da biyolojik bağlam etkilenir, belirli etkileşimli ortakların varlığı veya yokluğu gibi^4,hücre sinyal olayları, ve bir hücrenin gelişim evresi.

C. elegans yaygın geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar için bir model organizma olarak kullanılır. Bu hayvanın basit anatomisi, solucan gelişiminin analizini kolaylaştıran gonad, bağırsak ve şeffaf mitikül de dahil olmak üzere çeşitli organlardan oluşur. Gonad’da yaşayan germin, germline kök hücrelerinin embriyolara ve sonunda yeni nesil singenlere dönüşen^{gametler 5’e} nasıl olgunlaştığını incelemek için harika bir araçtır. Germline distal uç bölgesi kendi kendini yenileyen kök hücrelerden oluşan bir havuz içerir(Şekil 1). Kök hücreler niş bırakın gibi, onlar meiyotik pachytene içine ilerleme ve sonunda genç yetişkin aşamasında yumurta içine gelişir (Şekil 1). Germline geliştirme Bu program sıkı rna bağlayıcı proteinler (RRB)⁶tarafından kolaylaştırılen bir post-transkripsiyonel düzenleyici ağ da dahil olmak üzere farklı mekanizmalar aracılığıyla düzenlenir. PpI’lar bu düzenleyici etkinlik için önemlidir, çünkü KP’ler işlevlerini yerine getirmek için diğer kofaktörlerle ilişkilendirilir.

Solucanda PPI’lar için sondalamak için kullanılabilecek çeşitli yaklaşımlar vardır, ancak her birinin benzersiz sınırlamaları vardır. In vivo immünopresipite (IP) protein-protein komplekslerini tüm solucan özlerinden ayırmak için kullanılabilir; ancak bu yaklaşım, ÜFE’nin solucanda nerede oluştuğunu göstermez. Buna ek olarak, geçici ve sadece gelişim belirli bir aşamada veya sınırlı sayıda hücre de form protein kompleksleri co-immünopresid ile kurtarmak zor olabilir. Son olarak, IP deneyleri lysis ve afinite matris proteinlerin non-spesifik tutma sonra protein kompleksi reassortment endişeleri ele almak gerekir.

PPI yerinde tespiti için alternatif yaklaşımlar ko-immünboyama, Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve bimoleküler floresan kompleman (BiFC) vardır. Ko-immünboyama sabit solucan dokusunda ilgi iki protein eşzamanlı algılama ve sinyal kolokalizasyonu ölçüde ölçümü dayanır. Standart mikroskopi⁷daha fazla ayrıntı sunan süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımı, 200-300 nm⁸kırınım sınırlı bariyer ötesinde protein kolokalizasyonu daha sıkı test etmek için yardımcı olur. Ancak, hem konvansiyonel hem de süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak ko-immünboyama iyi tanımlanmış lokalizasyon desenleri olan proteinler için en iyi çalışır. Buna karşılık, yaygın olarak dağıtılan etkileşimli ortaklar için çok daha az bilgilendirici hale gelir. Örtüşmeye dayalı sinyallerin birlikte lokalizasyonu için ölçüm proteinlerin birbiriyle karmaşık olup olmadığı hakkında doğru bilgi sağlamaz^9,10.

Ayrıca, protein-protein komplekslerinin ko-immünopresipitasyon ve ko-immünboyboyama kantitatif değildir, bu tür etkileşimlerin önemli olup olmadığını belirlemek zor hale. FRET ve BiFC floresan tabanlı tekniklerdir. FRET floresan proteinler ile ilgi proteinleri etiketleme dayanır (FPs) hangi bir FP enerji transfer spektral örtüşme var (donör) başka bir FP (alıcı)¹¹aktarılır. Enerjinin bu radyatif olmayan transferi, kendi dalga boyunda tespit edilebilen alıcı FP’nin floresanlığına neden olur. BiFC in vivofloresan proteinin yeniden yapılandırılmasına dayanır. GFP’nin helikes 1-10 ve helix 11¹²gibi iki tamamlayıcı parçaya bölünmesini gerektirir ve bu parçalar daha sonra iki proteinle kaynaşır. Eğer bu iki protein etkileşirse, GFP’nin tamamlayıcı parçaları katlamak ve biraraya gelmek için yeterince yakınlaşır ve GFP floroforu yeniden kurar. Yeniden oluşturulan GFP daha sonra doğrudan floresan olarak gözlenir ve üfe’nin nerede oluştuğunu gösterir.

Bu nedenle, hem FRET hem de BiFC, etiketlenen proteinin işlevini bozabilecek büyük floresan etiketlere bağlıdır. Buna ek olarak, FRET ve BiFC doğru veri elde etmek için etiketli proteinlerin bol ve karşılaştırılabilir ifade gerektirir. FRET, bir ortağın diğerini aşan olduğu ve yüksek arka plan^13’eyol açabilen deneyler için uygun olmayabilir. BiFC denemelerinde aşırı ifadeden de kaçınılmalıdır, çünkü bu, daha yüksek arka planla sonuçlanan nonspesifik derleme^14’ü tetikleyebilir. Her iki teknik de, etiketli proteinlerin ekspresyonu ve görüntüleme koşullarının optimizasyonu gerektirir, bu da deneyleri tamamlamak için gereken süreyi uzatabilir.

Yakınlık ligasyon tsurju (PLA) yukarıda bahsedilen tekniklerin sınırlamalarını ele alabilecek alternatif bir yaklaşımdır. PLA, ilgi çeken proteinleri (veya etiketlerini) tanıyan birincil antikorlardan yararlanır. Bu primer antikorlar daha sonra 40 nm (veya daha kısa) mesafe¹⁵içinde birbirleriyle melezleşebilir oligonükleotid probları içeren ikincil antikorlar ile bağlanır. Ortaya çıkan melezdna, DNA’yı tamamlayan problar tarafından algılanan bir PCR reaksiyonu ile güçlenir. Bu bir mikroskop tarafından görselleştirilmiş foci sonuçlanır. Bu teknoloji, gelişim ve farklılaşmanın çeşitli aşamalarında hücreleri içeren bir montaj hattı olarak organize edilen karmaşık dokularda (yani solucan gonad) yerinde PPI’ları algılayabilir. PLA ile PPI’lar sabit solucan gonad’da doğrudan görselleştirilebilir, bu da PPI’ların gelişimin belirli bir aşamasında oluşup oluşmadığını araştırmak için avantajlıdır. PLA, kesin ölçümler yapmak için ideal olan eş-lokalizasyon tabanlı tahliller yerine PPI’lerin daha fazla çözünürlüğü sunar. Kullanılırsa, süper çözünürlüklü mikroskopi bir hücre içinde PLA foci konumu hakkında ince ayrıntı sağlama potansiyeline sahiptir. Başka bir avantajı pla reaksiyonları kaynaklanan foci bir ImageJ tabanlı analiz iş akışı ile sayılır olabilir, bu tekniği nicel hale.

Dynein Hafif Zincirleri LC8 ailesi ilk dynein motor kompleksi¹⁶ bir alt birim olarak tanımlanan ve bir kargo adaptörü olarak hizmet hipotezi. İlk keşfinden bu yana, LC8 dynein motor kompleksi ek olarak birden fazla protein kompleksleri bulunmuştur^17,18,19,20. LC8 etkileşim motifi içeren protein dizileri için tarama¹⁹ LC8 farklı proteinlerin geniş bir dizi ile birçok etkileşimleri olabileceğini düşündürmektedir^{17,18,19,20,21,22}. Sonuç olarak, LC8 aile proteinleri şimdi daha büyük protein kompleksleri montaj teşvik yardımcı hub olarak kabul edilir^19,22, özünde düzensiz proteinlerin meclisleri gibi²¹.

Bir C. elegans LC8-aile protein, dynein ışık zinciri-1 (DLC-1), yaygın birçok dokular arasında ifade edilir ve belirli hücre altı yapılarda zenginleştirilmiş değil^23,24. Sonuç olarak, C. elegans DLC-1 biyolojik olarak ilgili in vivo ortaklarının belirlenmesi çeşitli nedenlerle zor: 1) co-immünoprepitasyon etkileşimoluşur doku kaynağı göstermez; 2) belirli ortakların sınırlı ekspresyonu veya geçici etkileşimleri co-immünoprepitasyon ile bir etkileşimi tespit etme yeteneğini engelleyebilir; ve 3) DLC-1 diffüz dağılımı co-immünboyama tarafından potansiyel ortak proteinler ile non-spesifik örtüşme yol açar. Bu zorluklara dayanarak PLA, DLC-1 ile in vivo etkileşimlerini test etmek için ideal bir yaklaşımdır.

Daha önce DLC-1 ile doğrudan etkileşim ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB) FBF-2²³ ve GLD-1 25 için bir kofaktör olarak hizmet^{bildirilmiştir.} Çalışmalarımız dlc-1 bir hub protein olarak hizmet modeli destekler ve DLC-1 dynein ötesinde kapsayan bir etkileşim ağı kolaylaştırır düşündürmektedir^19,22. GST pulldown tetkik kullanarak, OMA-1 adlı yeni bir DLC-1-etkileşen RBP²⁶tespit edilmiştir. OMA-1 yumurta büyümesi ve meiyotik olgunlaşma²⁷ için önemlidir ve bir dizi çevirisel baskılayıcı ve aktivatörlerle birlikte işlevler^28. FBF-2 ve GLD-1 sırasıyla kök hücreler ve meyolitik pakiten bölgelerinde ifade edilirken, OMA-1 oositler²⁷ ile meiyotik pachytenden mikropta yaygın olarak ifade edilir (Şekil 1). Bu, DLC-1 gonad farklı bölgelerde RbPs ile kompleksleri oluşturur düşündürmektedir. Ayrıca in vitro gözlenen DLC-1 ve OMA-1 arasındaki doğrudan etkileşim in vivo IP ile kurtarılamadı bulunmuştur. PLA başarıyla C. elegans germline bu etkileşimi daha fazla çalışma için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılmıştır, ve sonuçlar PLA solucan diğer birçok PPIs araştırmak için kullanılabilir öneririz.