Se estima que más del 80% de las proteínas tienen interacciones con otras moléculas^1,lo que hace hincapié en la importancia de los IBP para la ejecución de funciones biológicas específicas en la célula^2. Algunas proteínas funcionan como centros que facilitan el montaje de complejos más grandes que son necesarios para la supervivencia celular¹. Estos concentradores median múltiples IBP y ayudan a organizar las proteínas en una red que facilita funciones específicas en una celda^3. La formación de complejos proteicos también se ve afectada por el contexto biológico, como la presencia o ausencia de socios interactuadores específicos^4,eventos de señalización celular y la etapa de desarrollo de una célula.

C. elegans se utiliza comúnmente como un organismo modelo para una variedad de estudios, incluyendo el desarrollo. La simple anatomía de este animal se compone de varios órganos, incluyendo la gónada, el intestino y la cutícula transparente, que facilita el análisis del desarrollo del gusano. La germlina que reside en la gónada es una gran herramienta para estudiar cómo las células madre germinales maduran en gametos⁵ que se convierten en embriones y, finalmente, en la próxima generación de progenie. La región de la punta distal de la línea germinal contiene un grupo de células madre autonuevas(Figura 1). A medida que las células madre salen del nicho, progresan hacia el paquiteno meiótico y finalmente se convierten en ovocitos en la etapa adulta joven(Figura 1). Este programa de desarrollo en la línea germinal está estrechamente regulado a través de diferentes mecanismos, incluyendo una red reguladora post-transcripción facilitada por proteínas de unión al ARN (RBP)⁶. Los IBP son importantes para esta actividad regulatoria, ya que los PBP se asocian con otros cofactores para ejercer sus funciones.

Hay varios enfoques que se pueden utilizar para sondear los IBP en el gusano, pero cada uno tiene limitaciones únicas. La inmunoprecipitación in vivo (IP) se puede utilizar para aislar complejos de proteínas y proteínas de extractos de gusanos enteros; sin embargo, este enfoque no indica dónde se produce el IBP en el gusano. Además, los complejos proteicos que son transitorios y sólo se forman durante una etapa específica de desarrollo o en un número limitado de células pueden ser difíciles de recuperar por co-inmunoprecipitación. Por último, los experimentos de IP deben abordar las preocupaciones del reordenamiento complejo de proteínas después de la lisis y la retención no específica de proteínas en la matriz de afinidad.

Los enfoques alternativos para la detección in situ de IBP son la co-inmunoingestión, la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) y la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC). La inmunoinserción se basa en la detección simultánea de dos proteínas de interés en el tejido de gusano fijo y la medición del alcance de la colocalización de la señal. El uso de la microscopía de superresolución, que ofrece un mayor detalle que la microscopía estándar^7,ayuda a probar más rigurosamente la colocalización de proteínas más allá de la barrera limitada por difracción de 200-300 nm^8. Sin embargo, la co-inmunomancha utilizando micromicroscopía convencional y de superresolución funciona mejor para proteínas con patrones de localización bien definidos. Por el contrario, se vuelve mucho menos informativo para los socios que interactúan distribuidas difusamente. La medición para la colocalización de señales basadas en la superposición no proporciona información precisa sobre si las proteínas están en complejo entre sí^9,10.

Además, la co-inmunoprecipitación y la co-inmuno-inmunoinactividad de los complejos proteína-proteína no son cuantitativas, por lo que es difícil determinar si tales interacciones son significativas. FRET y BiFC son técnicas fluorescentes. FRET se basa en el etiquetado de proteínas de interés con proteínas fluorescentes (FP) que tienen superposición espectral en la que la energía de un FP (donante) se transfiere a otro FP (aceptador)¹¹. Esta transferencia no radiativa de energía da lugar a la fluorescencia del FP aceptador que se puede detectar en su respectiva longitud de onda de emisión. BiFC se basa en la reconstitución de una proteína fluorescente in vivo. Implica dividir GFP en dos fragmentos complementarios, como hélices 1-10 y hélice 11^12,que luego se fusionan en dos proteínas de interés. Si estas dos proteínas interactúan, los fragmentos complementarios de GFP se vuelven lo suficientemente cercanos como para plegarse y ensamblarse, reconstituyendo el fluoróforo de GFP. La GFP reconstituida se observa directamente como fluorescencia e indica dónde se ha producido un IBP.

Como tal, tanto FRET como BiFC dependen de grandes etiquetas fluorescentes que pueden alterar la función de la proteína etiquetada. Además, FRET y BiFC requieren una expresión abundante y comparable de las proteínas etiquetadas para obtener datos precisos. FRET puede no ser adecuado para experimentos en los que un socio es superior al otro, lo que puede conducir a un fondo alto¹³. También se debe evitar la sobreexpresión en experimentos DeFC, ya que esto puede inducir un ensamblado no específico¹⁴ que da lugar a un mayor fondo. Ambas técnicas requieren la optimización de las condiciones de expresión e imagen de las proteínas etiquetadas, lo que puede prolongar el tiempo necesario para completar los experimentos.

El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) es un enfoque alternativo que puede abordar las limitaciones de las técnicas mencionadas anteriormente. PLA aprovecha los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas de interés (o sus etiquetas). Estos anticuerpos primarios están enlazados por anticuerpos secundarios que contienen sondas de oligonucleótidos que pueden hibridarentrelazados entre sí cuando están dentro de una distancia de 40 nm (o más corta)^15. El ADN hibridado resultante se amplifica a través de una reacción PCR, que es detectada por sondas que complementan el ADN. Esto da como resultado focos que son visualizados por un microscopio. Esta tecnología puede detectar IBP in situ en tejidos complejos (es decir, la gónada de gusano), que se organiza como una línea de ensamblaje que contiene células en varias etapas de desarrollo y diferenciación. Con PLA, los IBP se pueden visualizar directamente en una gónada de gusano fija, lo que es ventajoso para investigar si los IBP se producen durante una etapa específica de desarrollo. PLA ofrece una mayor resolución de los IBP en comparación con los ensayos basados en la colocalización, que es ideal para realizar mediciones precisas. Si se utiliza, la microscopía de superresolución tiene el potencial de proporcionar detalles más finos sobre la ubicación de los focos de PLA dentro de una célula. Otra ventaja es que los focos resultantes de las reacciones PLA pueden ser contados por un flujo de trabajo de análisis basado en ImageJ, haciendo que esta técnica sea cuantitativa.

La familia LC8 de cadenas ligeras de dynein fue descrita por primera vez como una subunidad del complejo de motores de dinin¹⁶ e hipotetizado para servir como adaptador de carga. Desde su descubrimiento inicial, LC8 se ha encontrado en múltiples complejos proteicos además del complejo motor de dinina^{17,,18,,19,,20.} El escaneo de secuencias de proteínas que contienen el motivo de interacción LC8¹⁹ sugiere que LC8 puede tener muchas interacciones con una amplia gama de diferentes proteínas^{17,,18,19,20,21,22}. Como resultado, las proteínas de la familia LC8 ahora se consideran centros que ayudan a promover el ensamblaje de complejos proteicos más grandes^19,,22, como ensamblajes de proteínas intrínsecamente desordenadas^21.

Una proteína de la familia C. elegans LC8, cadena de luz de dinneina-1 (DLC-1), se expresa ampliamente en muchos tejidos y no se enriquece en estructuras subcelulares específicas^23,24. En consecuencia, la identificación de socios in vivo biológicamente relevantes de DLC-1 en C. elegans es difícil por varias razones: 1) la coinmunoprecipitación no indica la fuente de tejido donde se produce la interacción; 2) la expresión limitada de socios particulares o las interacciones transitorias pueden obstaculizar la capacidad de detectar una interacción por coinmunoprecipitación; y 3) la distribución difusa de DLC-1 conduce a una superposición no específica con las proteínas potenciales asociadas mediante la inmunoingestión. Basado en estos desafíos, PLA es un enfoque ideal para probar interacciones in vivo con DLC-1.

Se ha informado previamente que DLC-1 interactúa directamente con y sirve como cofactor para las proteínas de unión al ARN (RBP) FBF-2²³ y GLD-1²⁵. Nuestro trabajo apoya el modelo de DLC-1 sirviendo como proteína de cubo y sugiere que DLC-1 facilita una red de interacción que abarca más allá de la dinin^19,,22. Usando un ensayo desplegable GST, se ha identificado un nuevo RBP de interacción con DLC-1 denominado OMA-1²⁶. OMA-1 es importante para el crecimiento de ovocitos y la maduración meiótica²⁷ y funciona en conjunto con una serie de represores y activadores traslacionales^28. Mientras que FBF-2 y GLD-1 se expresan en las células madre y las regiones meioticas de paquiteno, respectivamente, OMA-1 se expresa difusamente en la línea germinal del paquiteno meiotico a través de los ovocitos²⁷ (Figura 1). Esto sugiere que el DLC-1 forma los complejos con los RBP en las diversas regiones de la gónada. También se ha encontrado que la interacción directa entre DLC-1 y OMA-1 observada in vitro no se recupera mediante una IP in vivo. El PLA se ha utilizado con éxito como un enfoque alternativo para estudiar más a fondo esta interacción en la línea germinal de C. elegans, y los resultados sugieren que el PLA se puede utilizar para sondear muchos otros IBP en el gusano.