Более 80% белков, по оценкам, имеют взаимодействия с другими молекулами¹, что подчеркивает, насколько важны ИЦП для выполнения конкретных биологических функций в клетке^2. Некоторые белки функционируют как концентраторы, облегчающие сборку более крупных комплексов, необходимых для выживания клеток^1. Эти концентраторы посредничают в нескольких ИЦП и помогают организовать белки в сеть, которая облегчает конкретные функции в ячейке^3. Формирование белковых комплексов также зависит от биологического контекста, такого как наличие или отсутствие конкретных взаимодействующих партнеров^4,события клеточной сигнализации и стадия развития клетки.

C. elegans обычно используется в качестве образцового организма для различных исследований, включая развитие. Простая анатомия этого животного состоит из нескольких органов, в ключая гонад, кишечник и прозрачную кутикулу, которая облегчает анализ развития червя. Зародышевая линия, проживающая в гонаде, является отличным инструментом для изучения того, как зародышевые стволовые клетки созревают в гаметы^5, которые превращаются в эмбрионы и, в конечном итоге, следующее поколение потомства. Дистальная область кончика зародышевой линии содержит пул самообновляющихся стволовых клеток(рисунок 1). Как стволовые клетки покидают нишу, они прогрессируют в мейотический пахитен и в конечном итоге превращаются в яйцеклетки в стадии молодых взрослых (Рисунок 1). Эта программа развития в зародышевой плотно регулируется с помощью различных механизмов, в том числе после транскрипционной регуляторной сети при содействии РНК-связывающих белков (RBPs)⁶. ИЦП имеют важное значение для этой регулятивной деятельности, поскольку ОРП связываются с другими кофакторами для осуществления своих функций.

Есть несколько подходов, которые могут быть использованы для зондирования Для ИЦП в червя, но каждый из них имеет уникальные ограничения. In vivo immunoprecipitation (IP) может быть использован для изоляции белково-белковых комплексов из экстрактов цельного червя; однако этот подход не указывает, где происходит ИЦП у червя. Кроме того, белковые комплексы, которые являются преходящими и только образуются на определенном этапе развития или в ограниченном количестве клеток может быть трудно восстановить путем совместного иммунопреципции. Наконец, IP-эксперименты должны решать проблемы белкового комплекса reassortment после лиза и неспецифического удержания белков на матрице сродства.

Альтернативными подходами к обнаружению ИЦП на месте являются совместное иммуносохранение, рецензирование фюрстерской резонансной передачи энергии (ФРЭТ) и бимолекулярная флуоресценция (BiFC). Совместное иммуностоирование опирается на одновременное обнаружение двух белков, представляющих интерес для фиксированной ткани червя, и измерение степени колокализации сигнала. Использование микроскопии сверхразрешения, которая предлагает более подробную информацию, чем стандартная микроскопия^7,помогает более строго проверить колокализацию белка за пределами дифракционно-ограниченного барьера 200-300 нм⁸. Тем не менее, совместное иммуноскопии с использованием как обычных, так и супер-разрешение микроскопии лучше всего подходит для белков с четко определенными шаблонами локализации. В отличие от этого, он становится гораздо менее информативным для диффузно распределенных взаимодействующих партнеров. Измерение для совместной локализации сигналов на основе перекрытия не дает точной информации о том, являются ли белки в комплексе друг с другом^9,,10.

Кроме того, совместное иммунопрецитификации и совместное иммуно-дентинирование белково-белковых комплексов не являются количественными, что затрудняет определение того, являются ли такие взаимодействия значительными. FRET и BiFC являются методами флуоресцентной основе. FRET опирается на пометки белков, представляющих интерес с флуоресцентными белками (FPs), которые имеют спектральное перекрытие, при котором энергия от одного FP (донор) передается другому FP (приемору)¹¹. Эта нерадиационная передача энергии приводит к флуоресценции принимающего FP, которые могут быть обнаружены на соответствующей длине волны выбросов. BiFC основан на восстановлении флуоресцентного белка in vivo. Это влечет за собой разделение GFP на два дополнительных фрагмента, таких как сиксы 1-10 и сугнишие 11¹², которые затем сливается с двумя белками, представляющими интерес. Если эти два белка взаимодействуют, дополнительные фрагменты GFP становятся достаточно близкими в непосредственной близости к разить и собрать, воскворуя фторфор GFP. Восстановленный GFP затем непосредственно наблюдается как флуоресценция и указывает, где иЦП произошло.

Таким образом, как FRET и BiFC зависит от больших флуоресцентных тегов, которые могут нарушить функцию помечены белка. Кроме того, FRET и BiFC требуют обильного и сопоставимого выражения помеченных белков для получения точных данных. FRET не может быть пригодным для экспериментов, где один партнер превышает другой, что может привести к высокому фону¹³. Следует также избегать переэкспрессии в экспериментах BiFC, так как это может вызвать неспецифическую сборку^14, что приводит к увеличению фона. Оба метода требуют оптимизации экспрессии и условий визуализации помеченных белков, что может продлить время, необходимое для завершения экспериментов.

Перегоняемая близость анализа (PLA) является альтернативным подходом, который может решить ограничения методов, упомянутых выше. НОАК использует первичные антитела, которые распознают белки, представляющие интерес (или их теги). Эти первичные антитела затем связаны вторичными антителами, содержащими олигонуклеотидные зонды, которые могут гибридизироваться друг с другом, когда в пределах 40 нм (или короче) расстояние¹⁵. В результате гибридизированная ДНК усиливается через реакцию ПЦР, которая обнаруживается зондами, которые дополняют ДНК. Это приводит к foci, которые визуализированы микроскопом. Эта технология может обнаружить ИЦП на месте в сложных тканях (т.е. червь гонад), который организован как сборочная линия, содержащая клетки на различных стадиях развития и дифференциации. С PLA, ИЦП могут быть непосредственно визуализированы в фиксированной гонад червя, что выгодно для расследования ли ИЦП происходят на определенном этапе развития. НОАК предлагает более четкое разрешение ИЦП в отличие от анализов на основе совместной локализации, что идеально подходит для проведения точных измерений. При использовании микроскопия сверхразрешения может обеспечить более подробную информацию о местонахождении очагов PLA в клетке. Еще одним преимуществом является то, что фокусы, возникающие в результате реакций НОАК, могут быть подсчитаны по рабочему процессу на основе анализа ImageJ, что делает этот метод количественным.

Семейство световых цепей dynein было впервые описано как подразделение динейнского моторного комплекса¹⁶ и предположило, что служит грузовым адаптером. С момента своего первого открытия, LC8 был найден в нескольких белковых комплексов в дополнение к динейн моторный комплекс^17,18,19,20. Сканирование для белковых^{последовательностей,}которые содержат мотив взаимодействия LC8¹⁹ предполагает, что LC8 может иметь много взаимодействий с широким спектром различных белков^17,18,19,^20,21,22. В результате, LC8 семейные белки в настоящее время считаются концентраторами, которые помогают содействовать сборке больших белковых комплексов^19,,22, таких как сборки внутренне неупорядоченных белков²¹.

Один C. elegans LC8-семейный белок, динеин световой цепи-1 (DLC-1), широко выражается во многих тканях и не обогащается в конкретных подклеточных структурах^23,24. Следовательно, выявление биологически значимых партнеров in vivo DLC-1 в C. elegans является сложной задачей по ряду причин: 1) совместное иммунопрецитность не указывает источник ткани, где происходит взаимодействие; 2) ограниченное выражение конкретных партнеров или переходных взаимодействий может препятствовать способности обнаруживать взаимодействие путем совместного иммунопреципции; и 3) диффуза распределения DLC-1 приводит к неспецифическому совпадению с потенциальными белками партнера путем совместного иммуносохранения. Основываясь на этих проблемах, PLA является идеальным подходом для тестирования взаимодействия in vivo с DLC-1.

Ранее сообщалось, что DLC-1 напрямую взаимодействует и служит кофактором для РНК-связывающих белков (RBPs) FBF-2²³ и GLD-1^25. Наша работа поддерживает модель DLC-1, выступающей в качестве концентратора белка и предполагает, что DLC-1 облегчает взаимодействие сети, которая охватывает за dynein^19,22. Используя GST выпадение ассс, новый DLC-1-взаимодействующих RBP имени OMA-1 был определен²⁶. OMA-1 имеет важное значение для роста яйцеклеток и мейотического созревания²⁷ и функционирует в сочетании с рядом переводческих репрессаторов и активаторов^28. В то время как FBF-2 и GLD-1 выражены в стволовых клетках и мейотических областях пахитена, соответственно, OMA-1 диффузно выражается в зародыше из мейотического пахитена через яоциты²⁷ (Рисунок 1). Это говорит о том, что DLC-1 формирует комплексы с ОДП в разных регионах гонада. Было также установлено, что прямое взаимодействие между DLC-1 и OMA-1 наблюдается in vitro не восстанавливается in vivo IP. НОАК была успешно использована в качестве альтернативного подхода для дальнейшего изучения этого взаимодействия в Зародышевой линии C. elegans, и результаты показывают, что НОАК может быть использован для зондирования многих других ИЦП у червя.