タンパク質の80%以上が他の分子1との相互作用を有すると推定^{されており、細胞2}における特定の生物学的機能の実行においてPPIがいかに重要であるかを強調している。一部のタンパク質は、細胞生存に必要なより大きな複合体の組立を促進するハブとして機能する¹.これらのハブは複数の PPI を仲介し、細胞³の特定の機能を容易にするネットワークにタンパク質を整理するのに役立ちます。タンパク質複合体の形成は、特異的相互作用パートナー⁴の有無、細胞シグナル伝達事象、および細胞の発達段階などの生物学的文脈によっても影響される。

C.エレガンスは、開発を含む様々な研究のためのモデル生物として一般的に使用されています。この動物の単純な解剖学は、生殖腺、腸、透明キューティクルを含むいくつかの器官で構成されており、ワームの発達の分析を容易にする。生殖腺に存在する生殖細胞は、生殖細胞幹細胞が胚に成長し、最終的には次世代の子孫に^{成長するジ}テ5に成熟する方法を研究するのに最適なツールです。生殖細胞系列の遠位先端領域には、自己更新幹細胞のプールが含まれています(図1)。幹細胞がニッチを離れると、それらは大乳頭蓋に進行し、最終的には若年成人期に卵母細胞に発展する(図1)。生殖細胞系列におけるこの開発プログラムは、RNA結合タンパク質(RRP)6によって促進される転写後調節ネットワークを含む異なるメカニズムを介して厳しく調節される。⁶PPPは、RPPが他の補因子と関連付けて機能を発揮するので、この規制活動にとって重要です。

ワームの PPI をプローブするために使用できる方法はいくつかありますが、それぞれに固有の制限があります。インビボ免疫沈降(IP)は、ワーム抽出物全体からタンパク質-タンパク質複合体を分離するために使用することができます。ただし、このアプローチは、ワーム内で PPI が発生する場所を示すものではありません。さらに、開発の特定の段階または限られた数の細胞の中で一過性で唯一形成されるタンパク質複合体は、共免疫沈降法によって回収することが困難であり得る。最後に、IP実験では、アフィニティーマトリックス上のタンパク質のリシスおよび非特異的保持後のタンパク質複合体再分類の懸念に対処する必要があります。

PPIのインシチュ検出における代替アプローチは、共免疫染色、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)、および二分子蛍光相補(BiFC)である。コ免疫染色は、固定ワーム組織での目的とする2つのタンパク質の同時検出と、シグナルの共局在化の程度の測定に依存します。標準的な顕微鏡検査⁷よりも詳細な超解像顕微鏡の使用は、200-300^nm8の回折限界障壁を越えてタンパク質の共局在化をより厳格にテストするのに役立ちます。しかし、従来の顕微鏡と超解像顕微鏡の両方を使用した共同免疫染色は、明確に定義されたローカリゼーションパターンを持つタンパク質に最適です。対照的に、拡散分散型の相互作用パートナーにとってはあまり有益ではありません。重複に基づいてシグナルの共局在化を測定しても、タンパク質が互いに複雑であるかどうかについては正確な情報を提供しません^9,,10.

さらに、タンパク質複合体の共免疫沈降と共免疫染色は定量的ではなく、そのような相互作用が有意であるかどうかを判断することは困難です。FRETとBiFCは、いずれも蛍光ベースの技術です。FRETは、あるFP(ドナー)からのエネルギーが別のFP(アクセプタ⁾¹¹に伝達されるスペクトル重複を有する蛍光タンパク質(FP)と関心のあるタンパク質をタグ付けすることに依存する。このエネルギーの非放射移動は、それぞれの発光波長で検出することができるアクセクサFPの蛍光をもたらす。BiFCは、インビボの蛍光タンパク質の再構成に基づいています。これは、ヘリックス1-10とヘリックス11¹²などの2つの相補的な断片にGFPを分割し、その後、対象となる2つのタンパク質に融合することを必要とします。これら2つのタンパク質が相互作用する場合、GFPの相補的な断片は、折り畳み式と組み立てに十分近く、GFPフルオロフォアを再構成するほど近くなります。再構成されたGFPは、蛍光として直接観察され、PPIが発生した場所を示す。

そのため、FRETとBiFCの両方が、タグ付きタンパク質の機能を破壊する可能性のある大きな蛍光タグに依存しています。さらに、FRETとBiFCは、正確なデータを得るためにタグ付きタンパク質の豊富で同等の発現を必要とします。FRETは、一方のパートナーが他方を超えている実験には適しておらず、高い背景¹³につながる可能性がある。BiFC実験における過剰発現は、背景の増加をもたらす非特異的アセンブリ¹⁴を誘発する可能性もあるので、避けるべきである。どちらの手法でも、タグ付きタンパク質の発現条件と画像化条件の最適化が必要であり、実験の完了に必要な時間が長くなる可能性があります。

近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、上述の技術の限界に対処できる代替アプローチである。PLAは、目的のタンパク質(またはそのタグ)を認識する一次抗体を利用します。これらの一次抗体は、40nm(または短い)距離¹⁵内で互いにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含む二次抗体によって結合される。得られたハイブリダイズされたDNAはPCR反応を通じて増幅され、DNAを補うプローブによって検出される。これは顕微鏡によって視覚化される病巣で起因する。この技術は、複雑な組織(すなわち、ワーム生殖腺)においてPPIを検出することができ、これは、開発および分化の様々な段階で細胞を含む組立ラインとして組織される。PLAを使用すると、PPIは固定ワーム生殖腺で直接視覚化することができ、開発の特定の段階でPPIが発生するかどうかを調査する上で有利です。PLAは、正確な測定に最適な共ローカリゼーションベースのアッセイとは対照的に、PPIの解像度を高めます。使用する場合、超解像顕微鏡は、細胞内のPLA病巣の位置についてのより細かい詳細を提供する可能性を有する。もう1つの利点は、PLA反応に起因する病巣をImageJベースの解析ワークフローで数えることができることであり、この技術を定量化する。

ダイニン軽鎖のLC8ファミリーは、最初にダイニンモーター複合体¹⁶のサブユニットとして記述され、貨物アダプタとして機能すると仮定した。^,最初の発見以来、LC8はダイニンモーター複合体^{17、18、19、20,18,19}に加えて複数のタンパク質複合体で発見された。²⁰LC8相互作用モチーフ¹⁹を含むタンパク質配列のスキャンは、LC8^,が^,17、18、19、20、21、22の異なるタンパク質の広い配列との多くの相互作用^{17,18,1921を22}有し得る可能性があることを示唆している。²⁰その結果、LC8ファミリータンパク質は現在、より大きなタンパク質複合体^19,22,22の組立を促進するのに役立つハブと考^{えられている。}

1つのC.エレガンスLC8ファミリータンパク質は、ダイニン軽鎖-1(DLC-1)が、多くの組織にわたって広く発現しており、特異的な細胞下構造^23,24,24では濃縮されていない。その結果、C.エレガンスにおけるDLC-1の生体内パートナーの生物学的に関連する同定は、いくつかの理由で困難である:1)共免疫沈降は、相互作用が起こる組織源を示さない。2)特定のパートナーの限定的な発現または一時的相互作用は、共免疫沈降による相互作用を検出する能力を妨げる可能性がある;3) DLC-1の拡散分布は、共免疫染色により、潜在的なパートナータンパク質と非特異的な重複を招く。これらの課題に基づいて、PLAは、DLC-1とのインビボ相互作用をテストするための理想的なアプローチです。

DLC-1はRNA結合タンパク質(RRP)FBF-223およびGLD-1²⁵と直接相互作用し、補間因子として機能することが以前に報告²⁵されている。我々の研究は、ハブタンパク質として機能するDLC-1のモデルをサポートし、DLC-1がdynein^19,22,22を超えた相互作用ネットワークを促進することを示唆している。GST プルダウンアッセイを使用して、OMA-1 という名前の新しい DLC-1 相互作用 RBP が²⁶と特定されました。OMA-1は、卵母細胞の成長および大動脈成熟²⁷および多数の翻訳リプレッサーおよび活性化剤²⁸と共に機能する重要である。FBF-2およびGLD-1は幹細胞領域および重症パキテーン領域でそれぞれ発現しているが、OMA−1は、大母細胞²⁷を通る大動脈パキテーンから生殖細胞で拡散的に発現される(図1)。これは、DLC-1が生殖腺の異なる領域にRMPを有する複合体を形成することを示唆している。また、インビトロで観察されたDLC-1とOMA-1の間の直接相互作用は、in vivo IPによって回収されないことも判明した。PLAは、C.エレガンス生殖細胞系列におけるこの相互作用をさらに研究するための代替アプローチとしてうまく使用されており、その結果、PLAを使用してワーム内の他の多くのPPIを探査できることを示唆している。