On estime que plus de 80 % des protéines ont des interactions avec d’autres molécules¹, ce qui souligne l’importance des IPP pour l’exécution de fonctions biologiques spécifiques dans la cellule². Certaines protéines fonctionnent comme des plaques tournantes facilitant l’assemblage de plus grands complexes qui sont nécessaires pour la survie cellulaire¹. Ces moyeux médiateur plusieurs IPP et aider à organiser des protéines dans un réseau qui facilite des fonctions spécifiques dans une cellule³. La formation de complexes protéiques est également affectée par le contexte biologique, comme la présence ou l’absence de partenaires interagissant spécifiques^4,les événements de signalisation cellulaire et le stade de développement d’une cellule.

C. elegans est couramment utilisé comme organisme modèle pour une variété d’études, y compris le développement. La simple anatomie de cet animal est composée de plusieurs organes, dont le gonad, l’intestin et la cuticule transparente, ce qui facilite l’analyse du développement du ver. La lignée germinale résidant dans le gonad est un excellent outil pour étudier comment les cellules souches germinales mûrissent en^{gamètes 5} qui se développent en embryons et éventuellement la prochaine génération de progéniture. La région de pointe distale de la lignée germinale contient un bassin de cellules souches auto-renouvelées(figure 1). Au fur et à mesure que les cellules souches quittent la niche, elles se transforment en pachytène méiotique et finissent par se transformer en oocytes au stade des jeunes adultes(figure 1). Ce programme de développement dans la lignée germinale est étroitement réglementé par différents mécanismes, y compris un réseau de réglementation post-transcriptionnelle facilité par des protéines liant l’ARN (RBP)⁶. Les IPP sont importantes pour cette activité réglementaire, car les RBP s’associent à d’autres cofacteurs pour exercer leurs fonctions.

Il existe plusieurs approches qui peuvent être utilisées pour sonder les IPP dans le ver, mais chacune a des limites uniques. L’immunoprécipitation in vivo (IP) peut être utilisée pour isoler les complexes protéiques-protéines des extraits de vers entiers; cependant, cette approche n’indique pas où l’IPP se produit dans le ver. En outre, les complexes protéiques qui sont transitoires et ne se forment qu’à un stade spécifique de développement ou dans un nombre limité de cellules peuvent être difficiles à récupérer par co-immunoprécipitation. Enfin, les expériences de propriété intellectuelle doivent répondre aux préoccupations du réassorignement complexe en protéines après lyse et de la rétention non spécifique des protéines sur la matrice d’affinité.

Les approches alternatives pour la détection in situ des IPP sont la co-immunostaining, le transfert d’énergie de résonance de la résonance (FRET) et la compléments de fluorescence bimoléculaire (BiFC). La co-immunostaining repose sur la détection simultanée de deux protéines d’intérêt dans le tissu ver fixe et la mesure de l’étendue de la colocalisation du signal. L’utilisation de la microscopie super-résolution, qui offre plus de détails que la microscopie^{standard 7}, aide à tester plus rigoureusement la colocalisation des protéines au-delà de la barrière limitée à la diffraction de 200-300 nm⁸. Cependant, la co-immunostaining utilisant la microscopie conventionnelle et super-résolution fonctionne mieux pour des protéines avec des modèles bien définis de localisation. En revanche, il devient beaucoup moins instructif pour les partenaires en interaction distribués de façon diffuse. Mesurer la co-localisation des signaux en fonction du chevauchement ne fournit pas d’informations précises sur la question de savoir si les protéines sont en complexité^{les unes}avec les autres 9^,10.

En outre, la co-immunoprecipitation et la co-immunostaining des complexes protéines-protéines ne sont pas quantitatives, ce qui rend difficile de déterminer si de telles interactions sont significatives. FRET et BiFC sont deux techniques fluorescentes. FRET s’appuie sur le marquage des protéines d’intérêt avec des protéines fluorescentes (FP) qui ont chevauchement spectral à laquelle l’énergie d’un FP (donneur) est transférée à un autre FP (accepteur)¹¹. Ce transfert nonradiatif d’énergie entraîne la fluorescence de l’accepteur FP qui peut être détectée à sa longueur d’onde respective d’émission. BiFC est basé sur la reconstitution d’une protéine fluorescente in vivo. Il s’agit de diviser GFP en deux fragments complémentaires, tels que les hélies 1-10 et l’hélice 11¹², qui sont ensuite fusionnés à deux protéines d’intérêt. Si ces deux protéines interagissent, les fragments complémentaires de GFP deviennent assez proches à proximité pour se coucher et assembler, reconstituant le fluorophore GFP. Le GFP reconstitué est alors directement observé comme fluorescence et indique où un IPP s’est produit.

En tant que tel, FRET et BiFC dépendent de grandes étiquettes fluorescentes qui peuvent perturber la fonction de la protéine étiquetée. En outre, FRET et BiFC ont besoin d’une expression abondante et comparable des protéines étiquetées pour obtenir des données précises. FRET peut ne pas convenir à des expériences où l’un des partenaires est au-dessus de l’autre, ce qui peut conduire à un arrière-plan élevé¹³. La surexpression dans les expériences BiFC devrait également être évitée, car cela peut induire l’assemblage non spécifique¹⁴ qui a comme conséquence l’arrière-plan accru. Les deux techniques nécessitent l’optimisation des conditions d’expression et d’imagerie des protéines étiquetées, ce qui peut prolonger le temps nécessaire pour terminer les expériences.

L’essai de ligation de proximité (PLA) est une approche alternative qui peut répondre aux limites des techniques mentionnées ci-dessus. L’APL tire parti des anticorps primaires qui reconnaissent les protéines d’intérêt (ou leurs étiquettes). Ces anticorps primaires sont ensuite liés par des anticorps secondaires contenant des sondes d’oligoucléotide qui peuvent s’hybrider les uns avec les autres lorsqu’ils se trouvent à une distance de 40 nm (ou plus courte)¹⁵. L’ADN hybride qui en résulte est amplifié par une réaction de PCR, qui est détectée par des sondes qui complètent l’ADN. Il en résulte des foyers qui sont visualisés par un microscope. Cette technologie permet de détecter les IPP in situ dans les tissus complexes (c’est-à-dire le gonad ver), qui est organisé comme une chaîne d’assemblage contenant des cellules à divers stades de développement et de différenciation. Avec l’APL, les IPP peuvent être directement visualisées dans un gonad de ver fixe, ce qui est avantageux pour déterminer si les IPP se produisent à un stade spécifique de développement. L’APL offre une plus grande résolution des IPP par opposition aux essais basés sur la co-localisation, ce qui est idéal pour effectuer des mesures précises. Si elle est utilisée, la microscopie super-résolution a le potentiel de fournir des détails plus fins sur l’emplacement des foyers PLA dans une cellule. Un autre avantage est que les foyers résultant des réactions de l’APL peuvent être comptés par un flux de travail d’analyse basé sur ImageJ, ce qui rend cette technique quantitative.

La famille LC8 de chaînes lumineuses de dynein a d’abord été décrite comme un sous-unité du complexe moteur de dynein¹⁶ et a émis l’hypothèse de servir d’adaptateur de cargaison. Depuis sa découverte initiale, LC8 a été trouvé dans de multiples complexes protéiques en plus du complexe moteur de dynein^17,18,19,20. Balayage pour les séquences de protéines qui contiennent le motif d’interaction LC8¹⁹ suggère que LC8 peut avoir de nombreuses interactions avec un large éventail de protéines différentes^{17,18,19,20,21,22}. En conséquence, les protéines de la famille LC8 sont maintenant considérées comme des plaques tournantes qui aident à promouvoir l’assemblage de plus grands complexes protéiques^19,22, tels que des assemblages de protéines intrinsèquement désordonnées²¹.

Une protéine de la famille C. elegans LC8, la chaîne de lumière de la dynein-1 (DLC-1), est largement exprimée sur de nombreux tissus et non enrichie dans des structures souscellulaires spécifiques^23,24. Par conséquent, l’identification des partenaires in vivo biologiquement pertinents de DLC-1 dans C. elegans est difficile pour un certain nombre de raisons : 1) la co-immunoprécipitation n’indique pas la source tissulaire où l’interaction se produit; 2) l’expression limitée de partenaires particuliers ou d’interactions transitoires peut entraver la capacité de détecter une interaction par co-immunoprécipitation; et 3) la distribution diffuse du DLC-1 entraîne un chevauchement non spécifique avec les protéines partenaires potentielles par co-immunostaining. Sur la base de ces défis, PLA est une approche idéale pour tester les interactions in vivo avec DLC-1.

Il a été précédemment rapporté que DLC-1 interagit directement avec et sert de cofacteur pour les protéines de liaison ARN (RBPs) FBF-2²³ et GLD-1²⁵. Notre travail prend en charge le modèle de DLC-1 servant de protéine de plaque tournante et suggère que DLC-1 facilite un réseau d’interaction qui s’étend au-delà de la dynein^19,22. À l’aide d’un essai de retrait de la TPS, un nouveau RBP d’interaction DLC-1 nommé OMA-1 a été identifié²⁶. OMA-1 est important pour la croissance oocyte et la maturation méiotique²⁷ et fonctionne en conjonction avec un certain nombre de répresseurs translationnels et activateurs²⁸. Alors que FBF-2 et GLD-1 sont exprimés dans les cellules souches et les régions méiotiques pachytene, respectivement, OMA-1 est exprimée diffusement dans la lignée germinale du pachytene méiotique par les oocytes²⁷ (figure 1). Ceci suggère que DLC-1 forme des complexes avec des RBPs dans différentes régions du gonad. Il a également été constaté que l’interaction directe entre DLC-1 et OMA-1 observée in vitro n’est pas récupérée par une ADRESSE in vivo. L’APL a été utilisé avec succès comme une approche alternative pour étudier plus avant cette interaction dans la lignée germinale C. elegans, et les résultats suggèrent que l’APL peut être utilisé pour sonder de nombreux autres IPP dans le ver.