Over 80 % af proteinerne skønnes at have interaktioner med andre molekyler¹, hvilket understreger , hvor vigtige PPI er for udførelsen af specifikke biologiske funktioner i cellen². Nogle proteiner fungerer som hubs, der letter samling af større komplekser, der er nødvendige for celleoverlevelse¹. Disse hubs formidler flere PPI’er og hjælper med at organisere proteiner i et netværk, der letter bestemte funktioner i en celle³. Dannelse af proteinkomplekser påvirkes også af biologisk kontekst, såsom tilstedeværelse eller fravær af specifikke interagerende partnere^4,cellesignaleringshændelser og udviklingsstadiet af en celle.

C. elegans er almindeligt anvendt som en model organisme for en række undersøgelser, herunder udvikling. Den enkle anatomi af dette dyr består af flere organer, herunder gonade, tarm, og gennemsigtig neglebånd, som letter analysen af orm udvikling. Den germline bosat i gonade er et fantastisk værktøj til at studere, hvordan germline stamceller modnes i gameter^5, der udvikler sig til embryoner og i sidste ende den næste generation af afkom. Kimlinens distale spidsregion indeholder en pulje af selvfornyende stamceller (figur 1). Som stamceller forlade niche, de fremskridt i meiotic pachytene og i sidste ende udvikle sig til oocytter i den unge voksne fase (Figur 1). Dette udviklingsprogram i germline er stramt reguleret gennem forskellige mekanismer, herunder en post-transskriptionel regulerende netværk faciliteret af RNA-bindende proteiner (RFP’ er)⁶. PPI er vigtige for denne regulerende aktivitet, da ropp’er forbinder med andre cofaktorer for at udøve deres funktioner.

Der er flere tilgange, der kan bruges til at sonde for PPI i ormen, men hver har unikke begrænsninger. In vivo immunnedbør (IP) kan bruges til at isolere protein-protein komplekser fra hele ormen ekstrakter; Denne fremgangsmåde angiver dog ikke, hvor PPI forekommer i ormen. Desuden kan proteinkomplekser, der er forbigående og kun dannes i et bestemt udviklingstrin eller i et begrænset antal celler, være vanskelige at genvinde ved co-immunudfældning. Endelig skal IP-eksperimenter tage fat på problemerne ved proteinkompleks resortiment efter lysis og ikke-specifik retention af proteiner på affinitetsmatrixen.

Alternative tilgange til in situ-påvisning af PPI er co-immunfarvning, Förster resonans energioverførsel (FRET) og bimolekylær fluorescens komplementation (BiFC). Co-immunfarvning er afhængig af samtidig påvisning af to proteiner af interesse i fast ormvæv og måling af omfanget af signalkolokalisering. Brug af mikroskopi med superopløsning, som giver flere detaljer end standardmikroskopi⁷, bidrager til strengere test af proteinkolokalisering ud over den diffraktionsbegrænsede barriere på 200-300 nm⁸. Co-immunfarvning ved hjælp af både konventionel og superopløsningsmikroskopi fungerer dog bedst for proteiner med veldefinerede lokaliseringsmønstre. Derimod bliver det langt mindre informativt for diffust distribuerede interagerende partnere. Måling med henblik på samlokalisering af signaler baseret på overlapning giver ikke nøjagtige oplysninger om , hvorvidt proteinerne er komplekse med hinanden^9,10.

Desuden er co-immunudfældning og co-immunfarvning af protein-protein komplekser ikke kvantitative, hvilket gør det udfordrende at afgøre, om sådanne interaktioner er betydelige. FRET og BiFC er begge fluorescerende teknikker. FRET er afhængig af mærkning af proteiner af interesse med fluorescerende proteiner (FPs), der har spektral overlapning, hvor energi fra en FP (donor) overføres til et andet FP (acceptor)¹¹. Denne ikke-radiative overførsel af energi resulterer i fluorescens af acceptorFP, som kan detekteres ved dens respektive emissionsbølgelængde. BiFC er baseret på rekonstitution af et fluorescerende protein in vivo. Det indebærer opdeling GFP i to komplementære fragmenter, såsom helices 1-10 og helix 11¹², som derefter smeltes til to proteiner af interesse. Hvis disse to proteiner interagerer, bliver de komplementære fragmenter af GFP tæt nok i nærheden til at folde og samle, hvilket genudgør GFP fluorophore. Rekonstitueret gfp observeres derefter direkte som fluorescens og angiver, hvor der er forekommet en PPI.

Som sådan er både FRET og BiFC afhængige af store fluorescerende tags, der kan forstyrre funktionen af det mærkede protein. Desuden kræver FRET og BiFC rigelige og sammenlignelige udtryk for de mærkede proteiner for at opnå nøjagtige data. FRET er muligvis ikke egnet til forsøg, hvor den ene partner overstiger den anden, hvilket kan føre til høj baggrund¹³. Overekspression i BiFC-forsøg bør også undgås, da dette kan fremkalde uspecifik samling^14, der resulterer i øget baggrund. Begge teknikker kræver optimering af de mærkede proteiners ekspressions- og billeddannelsesforhold, hvilket kan forlænge den tid, det tager at fuldføre eksperimenter.

Nærhedligation assay (PLA) er en alternativ tilgang, der kan løse begrænsningerne af de teknikker, der er nævnt ovenfor. PLA udnytter primære antistoffer, der genkender de proteiner af interesse (eller deres tags). Disse primære antistoffer bindes derefter af sekundære antistoffer, der indeholder oligonukleotidsonder, der kan hybridisere med hinanden, når der inden for en afstand på 40 nm (eller kortere)¹⁵. Den resulterende hybridiserede DNA forstærkes gennem en PCR-reaktion, som detekteres af sonder, der supplerer DNA’et. Dette resulterer i foci, der visualiseres af et mikroskop. Denne teknologi kan detektere PPI in situ i komplekse væv (dvs. ormen gonade), som er organiseret som en samlebånd, der indeholder celler på forskellige stadier af udvikling og differentiering. Med PLA kan PPI visualiseres direkte i en fast ormgode, hvilket er fordelagtigt for at undersøge, om PPI forekommer i en bestemt udviklingsfase. PLA tilbyder større opløsning af PPI i modsætning til co-lokaliseringsbaserede analyser, som er ideel til at foretage præcise målinger. Hvis det bruges, super-opløsning mikroskopi har potentiale til at give finere detaljer om placeringen af PLA foci i en celle. En anden fordel er, at foci som følge af PLA reaktioner kan tælles af en ImageJ-baseret analyse workflow, hvilket gør denne teknik kvantitativ.

LC8-familien af dynein-lyskæder blev først beskrevet som en underenhed af dynein motorkomplekset¹⁶ og en hypotese til at fungere som en lastadapter. Siden sin første opdagelse, LC8 er blevet fundet i flere proteinkomplekser ud over dynein motor kompleks^17,18,19,20. Scanning efter proteinsekvenser , der indeholder LC8 interaktionsmotivet¹⁹ , tyder på , at LC8 kan have mange interaktioner med en bred vifte af forskellige proteiner^{17,18,19,20,21,22}. Som et resultat, LC8 familie proteiner er nu betragtes som knudepunkter, der bidrager til at fremme samling af større protein komplekser^19,22, såsom samlinger af iboende uordnede proteiner²¹.

En C. elegans LC8-familie protein, dynein lyskæde-1 (DLC-1), er bredt udtrykt på tværs af mange væv og ikke beriget i specifikke subcellulære strukturer^23,24. Derfor er identifikation af biologisk relevante in vivo-partnere for DLC-1 i C. elegans udfordrende af en række årsager: 1) co-immunudfældning angiver ikke den vævskilde, hvor interaktionen finder sted. 2) begrænset ekspression af bestemte partnere eller forbigående interaktioner kan hindre evnen til at påvise en interaktion ved co-immunoudfældning; og 3) diffus distribution af DLC-1 fører til ikke-specifik overlapning med potentielle partnerproteiner ved co-immunfarvning. Baseret på disse udfordringer er PLA en ideel tilgang til test af in vivo interaktioner med DLC-1.

Det er tidligere blevet rapporteret, at DLC-1 interagerer direkte med og fungerer som en cofaktor for RNA-bindende proteiner (RBC’ er) FBF-2²³ og GLD-1²⁵. Vores arbejde understøtter modellen af DLC-1, der fungerer som et hubprotein, og foreslår, at DLC-1 letter et interaktionsnetværk, der strækker sig ud over dynein^19,,22. Ved hjælp af en GST pulldown analyse, en ny DLC-1-interagerende RBP opkaldt OMA-1 er blevet identificeret²⁶. OMA-1 er vigtig for oocytvækst og meiotisk modning²⁷ og fungerer sammen med en række translationelle repressorer og aktivatorer²⁸. Mens FBF-2 og GLD-1 udtrykkes i henholdsvis stamceller og meiotiske pachytenregioner, udtrykkes OMA-1 diffust udtrykt i kimen fra meiotisk pachyten gennem oocytterne²⁷ (Figur 1). Dette tyder på, at DLC-1 former komplekser med RAS i forskellige regioner af gonade. Det er også blevet konstateret, at den direkte interaktion mellem DLC-1 og OMA-1 observeret in vitro ikke er inddrevet af en in vivo IP. PLA er med succes blevet brugt som en alternativ tilgang til yderligere undersøgelse af denne interaktion i C. elegans germline, og resultaterne tyder på, at PLA kan bruges til at sonde mange andre PPI i ormen.