Over 80% av proteiner er anslått å ha interaksjoner med andre molekyler¹, noe som understreker hvor viktig PPI er for utførelsen av spesifikke biologiske funksjoner i celle². Noen proteiner fungerer som huber som letter montering av større komplekser som er nødvendige for celleoverlevelse¹. Disse hubene medierer flere PPI-er og bidrar til å organisere proteiner i et nettverk som letter bestemte funksjoner i en celle³. Dannelse av proteinkomplekser påvirkes også av biologisk kontekst, for eksempel tilstedeværelse eller fravær av spesifikke interagerende partnere^4,cellesignalhendelser og utviklingsstadium av en celle.

C. elegans brukes ofte som modellorganisme for en rekke studier, inkludert utvikling. Den enkle anatomien til dette dyret består av flere organer, inkludert gonad, tarm og gjennomsiktig skjellaget, noe som letter analysen av ormutvikling. Germline bosatt i gonad er et flott verktøy for å studere hvordan germline stamceller modnes til gametes⁵ som utvikler seg til embryoer og til slutt neste generasjon av avkom. Den distale spissen i germline inneholder et utvalg av selvfornyende stamceller (Figur 1). Som stamceller forlate nisje, de utvikler seg inn i meiotic pachytene og til slutt utvikle seg til oocytes i den unge voksne scenen (Figur 1). Dette utviklingsprogrammet i germline er tett regulert gjennom ulike mekanismer, inkludert et post-transkripsjonsbasert regulatorisk nettverk tilrettelagt av RNA-bindende proteiner (RbPs)⁶. PPI er viktig for denne regulatoriske aktiviteten, da RBPs forbinder med andre faktorer for å utøve sine funksjoner.

Det er flere tilnærminger som kan brukes til å sonde for PPI er i ormen, men hver har unike begrensninger. In vivo immunoprecipitation (IP) kan brukes til å isolere protein-protein komplekser fra hele orm ekstrakter; Denne tilnærmingen angir imidlertid ikke hvor PPI forekommer i ormen. I tillegg kan proteinkomplekser som er forbigående og bare dannes under et bestemt utviklingsstadium eller i et begrenset antall celler, være vanskelig å gjenopprette ved ko-immunnedbør. Til slutt må IP-eksperimenter ta opp bekymringene til proteinkompleks resortiment etter lysis og ikke-spesifikk oppbevaring av proteiner på affinitetsmatrisen.

Alternative tilnærminger for in situ påvisning av PPI er co-immunostaining, Förster resonans energioverføring (FRET), og bimolekylær fluorescens komplementering (BiFC). Ko-immunostaining er avhengig av samtidig påvisning av to proteiner av interesse i fast ormvev og måling av omfanget av signalkolokalisering. Bruk av superoppløsningsmikroskopi, som gir større detaljer enn standard mikroskopi^7,bidrar til å strengere teste proteinkolokalisering utover diffraksjonsbegrenset barriere på 200-300 nm⁸. Co-immunostaining ved hjelp av både konvensjonell og superoppløsningsmikroskopi fungerer imidlertid best for proteiner med veldefinerte lokaliseringsmønstre. Derimot blir det mye mindre informativt for diffust distribuerte samhandlende partnere. Måling for samlokalisering av signaler basert på overlapping gir ikke nøyaktig informasjon om proteinene er i kompleks med hverandre^9,10.

Videre er co-immunnedbør og co-immunostaining av protein-protein komplekser ikke kvantitative, noe som gjør det utfordrende å avgjøre om slike interaksjoner er betydelige. FRET og BiFC er begge fluorescerende teknikker. FRET er avhengig av merking av proteiner av interesse med fluorescerende proteiner (FPs) som har spektral overlapping der energi fra en FP (donor) overføres til en annen FP (acceptor)¹¹. Denne ikke-bestrålte overføringen av energi resulterer i fluorescens av acceptor FP som kan oppdages ved sin respektive bølgelengde av utslipp. BiFC er basert på rekonstituering av et fluorescerende protein in vivo. Det innebærer å dele GFP i to komplementære fragmenter, som helices 1-10 og helix 11¹², som deretter smeltes sammen til to proteiner av interesse. Hvis disse to proteinene samhandler, blir de komplementære fragmentene av GFP nær nok i nærheten av å brette og montere, rekonstituere GFP-fluorofanen. Rekonstituert GFP observeres deretter direkte som fluorescens og indikerer hvor en PPI har oppstått.

Som sådan er både FRET og BiFC avhengige av store fluorescerende koder som kan forstyrre funksjonen til det kodede proteinet. I tillegg krever FRET og BiFC rikelig og sammenlignbart uttrykk for de kodede proteinene for å oppnå nøyaktige data. FRET er kanskje ikke egnet for eksperimenter der en partner er i overkant av den andre, noe som kan føre til høy bakgrunn¹³. Overuttrykk i BiFC eksperimenter bør også unngås, da dette kan indusere uspesifikk montering¹⁴ som resulterer i økt bakgrunn. Begge teknikkene krever optimalisering av uttrykk og bildebehandlingsforhold for de merkede proteinene, noe som kan forlenge tiden som kreves for å fullføre eksperimenter.

Nærhetsanalysen (PLA) er en alternativ tilnærming som kan adressere begrensningene i teknikkene nevnt ovenfor. PLA utnytter primære antistoffer som gjenkjenner proteiner av interesse (eller deres koder). Disse primære antistoffene er deretter bundet av sekundære antistoffer som inneholder oligonucleotide prober som kan hybridisere med hverandre når innenfor en 40 nm (eller kortere) avstand¹⁵. Det resulterende hybridiserte DNA forsterkes gjennom en PCR-reaksjon, som oppdages av sonder som utfyller DNA. Dette resulterer i foci som visualiseres av et mikroskop. Denne teknologien kan oppdage PPI-er in situ i komplekse vev (dvs. ormen gonad), som er organisert som en samlebånd som inneholder celler på ulike stadier av utvikling og differensiering. Med PLA kan PPI-er visualiseres direkte i en fast ormgonad, noe som er en fordel for å undersøke om PPI-er forekommer under et bestemt utviklingsstadium. PLA tilbyr større oppløsning av PPI-er i motsetning til co-lokalisering-baserte analyser, som er ideell for å gjøre nøyaktige målinger. Hvis den brukes, har mikroskopi med superoppløsning potensial til å gi finere detaljer om plasseringen av PLA-foci i en celle. En annen fordel er at foci som følge av PLA reaksjoner kan telles av en ImageJ-basert analyse arbeidsflyt, noe som gjør denne teknikken kvantitativ.

LC8-familien av dyneinlyskjeder ble først beskrevet som en underenhet av dyneinmotorkomplekset¹⁶ og hypotetisk for å fungere som en lastadapter. Siden den første oppdagelsen har LC8 blitt funnet i flere proteinkomplekser i tillegg til dyneinmotorkomplekset^17,18,19,20. Skanning etter proteinsekvenser som inneholder LC8 interaksjonsmotivet¹⁹ antyder at LC8 kan ha mange interaksjoner med et bredt spekter av forskjellige proteiner^{17,,18,,19,,20,21,22}. Som et resultat anses LC8-familieproteiner nå som knutepunkter som bidrar til å fremme montering av større proteinkomplekser^19,22, for eksempel samlinger av iboende uordenproteiner²¹.

En C. elegans LC8-familie protein, dynein lyskjede-1 (DLC-1), er mye uttrykt over mange vev og ikke beriket i spesifikke subcellulære strukturer^23,24. Følgelig er identifisering av biologisk relevante in vivo partnere av DLC-1 i C. elegans utfordrende av en rekke grunner: 1) co-immunoprecipitation indikerer ikke vevskilden der interaksjonen oppstår; 2) begrenset uttrykk for bestemte partnere eller forbigående interaksjoner kan hindre evnen til å oppdage en interaksjon ved co-immunnedbør; og 3) diffus fordeling av DLC-1 fører til ikke-spesifikk overlapping med potensielle partnerproteiner ved ko-immunfarging. Basert på disse utfordringene er PLA en ideell tilnærming for testing av vivo-interaksjoner med DLC-1.

Det har tidligere blitt rapportert at DLC-1 samhandler direkte med og fungerer som en kofaktor for RNA-bindende proteiner (RBPs) FBF-2²³ og GLD-1²⁵. Vårt arbeid støtter modellen av DLC-1 som fungerer som et hubprotein og antyder at DLC-1 letter et interaksjonsnettverk som strekker seg utover dynein^19,22. Ved hjelp av en GST pulldown analyse, en ny DLC-1-samhandlende RBP kalt OMA-1 har blitt identifisert²⁶. OMA-1 er viktig for oocyte vekst og meiotisk modning²⁷ og funksjoner i forbindelse med en rekke translasjonelle undertrykkere og aktivatorer²⁸. Mens FBF-2 og GLD-1 uttrykkes i stamceller og meiotiske pachytene-regioner, er OMA-1 diffust uttrykt i kimlinjen fra den meiotiske pachytene gjennom oocytes²⁷ (Figur 1). Dette tyder på at DLC-1 danner komplekser med RBPs i forskjellige regioner av gonad. Det har også blitt funnet at den direkte interaksjonen mellom DLC-1 og OMA-1 observert in vitro ikke gjenopprettes av en in vivo IP. PLA har blitt brukt som en alternativ tilnærming til videre studier av denne interaksjonen i C. elegans germline, og resultatene tyder på at PLA kan brukes til å sondere mange andre PPIer i ormen.