使用接近连接测定在C.elegans Germline中对核糖蛋白复合体装配的实地检测

据估计，超过80%的蛋白质与其他分子^{有相互作用1，}这强调PPI对于在细胞²中执行特定生物功能的重要性。一些蛋白质作为中心，促进组装更大的复合物，这是细胞生存^{所必需的1。}这些中心调解多个PPI，并帮助组织蛋白质进入一个网络，促进细胞³中的特定功能。蛋白质复合物的形成也受到生物背景的影响，如存在或缺乏特定的相互作用伙伴^4、细胞信号事件和细胞的发育阶段。

C. elegans通常用作各种研究（包括发育）的模型有机体。这种动物的简单解剖由几个器官组成，包括果子、肠和透明角质，这有利于蠕虫发育的分析。居住在哥纳的生殖系是研究生殖系干细胞如何成熟成配体^5，发育成胚胎，并最终成为下一代后代的一个很好的工具。生殖系的远端区域包含一池自我更新的干细胞（图1）。当干细胞离开这个利基时，它们进入微离子pachytene，并最终在年轻的成人阶段发展成卵母细胞（图1）。该生殖系的发育方案通过不同的机制受到严格监管，包括由RNA结合蛋白（RBPs）6促进的转录后监管网络。⁶PPI 对于这一监管活动非常重要，因为限制性商业惯例与其他辅助因素相关联以发挥其职能。

有几种方法可用于探测蠕虫中的 PPI，但每种方法都有独特的限制。体内免疫沉淀（IP）可用于从整个蠕虫提取物中分离蛋白质-蛋白质复合物;但是，此方法并不指示 PPI 在蠕虫中的位置。此外，在特定的发育阶段或有限数量的细胞中，暂时性且仅形成的蛋白质复合物很难通过共同免疫沉淀来恢复。最后，IP实验需要解决在压解后蛋白质复杂重新分类以及蛋白质在亲和力基质上的非特异性保留后的问题。

PPI原位检测的替代方法是联合免疫染色、Fürster共振能量转移（FRET）和双分子荧光补充（BiFC）。联合免疫染色依赖于同时检测固定蠕虫组织中感兴趣的两种蛋白质，以及信号共定位程度的测量。使用超分辨率显微镜，它提供了比标准显微镜⁷更多的细节，有助于更严格地测试蛋白质共定位超过衍射限制屏障200-300 nm⁸。然而，使用常规和超高分辨率显微镜的共免疫染色最适合具有明确定位模式的蛋白质。相比之下，对于漫射分布的交互伙伴来说，它的信息量要少得多。测量基于重叠的信号的共定位并不能提供有关蛋白质是否彼此复杂^99、1010的准确信息。

此外，蛋白质-蛋白质复合物的共免疫沉淀和共同免疫染色不是定量的，因此很难确定这种相互作用是否显著。FRET 和 BiFC 都是基于荧光的技术。FRET依赖于标记感兴趣的蛋白质与荧光蛋白（FP），具有光谱重叠，其中能量从一个FP（捐赠者）转移到另一FP（接受者^）11。这种能量的非辐射转移导致接受方FP的荧光，可以在其各自的发射波长下检测到。BiFC是基于在体内重组荧光蛋白。它需要将GFP分成两个互补片段，如螺旋1-10和螺旋11^12，然后融合到两个感兴趣的蛋白质。如果这两种蛋白质相互作用，GFP的互补片段就变得足够接近折叠和组装，重建GFP荧光。重组后的 GFP 被直接观察为荧光，并指示 PPI 发生的位置。

因此，FRET 和 BiFC 都依赖于大型荧光标签，这些荧光标签会破坏标记蛋白的功能。此外，FRET 和 BiFC 需要大量且可比较地表达标记的蛋白质才能获得准确的数据。FRET 可能不适合一个伙伴超过另一个伙伴的实验，这可能导致高背景¹³。还应避免在 BiFC 实验中过度表达，因为这可能导致非特异性装配¹⁴导致背景增加。这两种技术都需要优化标记蛋白的表达和成像条件，这可能会延长完成实验所需的时间。

接近连接测定 （PLA） 是一种替代方法，可以解决上述技术的限制。PLA利用识别感兴趣的蛋白质（或其标签）的主要抗体。这些主要抗体然后由含有寡核苷酸探针的二次抗体结合，当在40纳米（或较短）距离¹⁵内时，这些抗体可以相互杂交。由此产生的杂交DNA通过PCR反应被放大，由补充DNA的探测器检测到。这将导致由显微镜可视化的 foci。该技术可以在复杂组织（即蠕虫腺体）中现场检测PPI，该组织为在发育和分化的不同阶段包含细胞的装配线。使用 PLA，PPI 可以直接可视化到固定蠕虫子，这有利于调查 PPI 是否在特定开发阶段发生。PLA 提供更高的 PPI 分辨率，而不是基于联合本地化的检测，这是进行精确测量的理想选择。如果使用，超高分辨率显微镜有可能提供有关PLA foci在细胞内位置的更精细的细节。另一个优点是，PLA反应产生的方法可以通过基于ImageJ的分析工作流进行计数，使这种技术具有定量性。

LC8系列的代宁光链最初被描述为Dynein电机复合体¹⁶的子单元，并假设作为货物适配器。自首次发现以来，LC8除了Dynein马达^,复合体^{17、18、19、20,18,19}外，还发现多种蛋白质复合物。²⁰扫描含有LC8相互作用图案^{的蛋白质序列19}表明LC8可能与各种不同的蛋白质有许多相互作用17，18，19，20，21，22。^{17,18,19,20,21,22}因此，LC8家族蛋白现在被认为是中心，帮助促进组装较大的蛋白质复合物^19，22，如内部紊乱蛋白质^{的组装21。19,}

一种C.elegansLC8系列蛋白质，代宁光链-1（DLC-1），广泛表达在许多组织中，不丰富在特定亚细胞结构^{23，24。,24}因此，由于多种原因，在C.elegans中确定DLC-1体内的体内伙伴是具有挑战性的：1） 共同免疫沉淀并不指示发生相互作用的组织源;2） 特定伴侣的有限表达或瞬态相互作用可能妨碍通过共同免疫沉淀检测相互作用的能力;和 3） DLC-1 的漫反射通过共同免疫染色导致与潜在伙伴蛋白的非特异性重叠。基于这些挑战，PLA 是测试与 DLC-1在体内交互的理想方法。

此前有报道称，DLC-1与RNA结合蛋白（BPS）FBF-223和GLD-125直接相互作用，并作为共同因子。^{23 25}我们的工作支持作为中心蛋白的DLC-1模型，并建议DLC-1促进一个超越Dynein^19，22,22的交互网络。使用 GST 下拉测定，已识别一个新的 DLC-1 交互 RBP 名为 OMA-1²⁶。OMA-1对卵母细胞生长和成熟很重要^27，并与一些转化抑制剂和活化剂²⁸一起功能。虽然FBF-2和GLD-1分别表达在干细胞和环太平洋区域，OMA-1在从卵母细胞²⁷的生殖系中漫射（图1）。这表明DLC-1在哥纳德的不同区域与限制性商业惯例形成复合体。还发现，在体外观察到的DLC-1和OMA-1之间的直接相互作用并没有通过体内IP恢复。人民解放军已经成功地作为另一种方法，进一步研究这种相互作用在C.elegans生殖系，结果表明，PLA可用于探索许多其他PPI在蠕虫。