Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen
Summary
Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.
Abstract
Haarzellen sind mechanosensorische Zellen, die das Hörgefühl vermitteln. Diese Zellen regenerieren sich nicht nach Schäden beim Menschen, sondern werden natürlich erweise bei nicht-mammalischen Wirbeltieren wie Zebrafischen aufgefüllt. Das Zebrafisch-Seitenliniensystem ist ein nützliches Modell zur Charakterisierung der sensorischen Haarzellregeneration. Die seitliche Linie besteht aus haarzellhaltigen Organen, die Neuromasten genannt werden und durch eine Reihe von Interneuromastzellen (INMCs) miteinander verbunden sind. INMCs fungieren als Vorläuferzellen, die während der Entwicklung neue Neuromasten hervorrufen. INMCs können Lücken im Seitlichleitungssystem reparieren, die durch den Zelltod entstehen. Hier wird ein Verfahren zur selektiven INMC-Ablation mit einem herkömmlichen Laserscanning-Konfokalmikroskop und transgenen Fischen beschrieben, die grünes fluoreszierendes Protein in INMCs ausdrücken. Die Zeitraffermikroskopie wird dann verwendet, um die INMC-Regeneration zu überwachen und die Rate des Lückenschlusses zu bestimmen. Dies stellt ein zugängliches Protokoll für die Zellablation dar, das keine spezielle Ausrüstung erfordert, wie z. B. einen hochbetriebenen, gepulsten ultravioletten Laser. Das Ablationsprotokoll kann breiteren Interessen dienen, da es für die Ablation zusätzlicher Zelltypen nützlich sein könnte, wobei ein Toolsatz verwendet wird, der bereits vielen Benutzern zur Verfügung steht. Diese Technik wird die Charakterisierung der INMC-Regeneration unter verschiedenen Bedingungen und aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen weiter ermöglichen, was das Verständnis der sensorischen Regeneration von Vorläuferzellen fördern wird.
Introduction
Der Kern des progressivsten Hörverlusts liegt in der Zerstörung sensorischer Haarzellen, die extrinsische Hörreize in vom Gehirn nachweisbare Nervenimpulse umleiten. Cochlea-Haarzelltod verursacht dauerhaften Hörverlust, da erwachsene Säugetiere nicht in der Lage sind, diese Zellen nach Schäden zu regenerieren. Umgekehrt können nicht-mammalische Wirbeltiere wie Zebrafische Haarzellen regenerieren, die durch akustische Traumata oder ototoxische Beleidigungen verloren gehen. Die Zebrafisch mechanosensorische Seitenlinie ist ein einfaches und leicht manipuliertes Organsystem, das verwendet werden kann, um Haarzellregeneration1,2,3.
Die seitliche Linie besteht aus kleinen sensorischen Flecken, neuromasten genannt, die während der Entwicklung durch eine Reihe von länglichen Zellen verbunden sind, die als Interneuromastzellen (INMCs) bekannt sind. Angesichts ihrer proliferativen Fähigkeit als scheinbare Stammzellen, die neue haarzellhaltige Organe hervorrufen, ist das Verhalten von INMCs von großem Interesse für die Gemeinschaft4,5. Ein Großteil der Forschung im Zusammenhang mit INMCs hat die Unterdrückung ihrer Proliferation durch nahe gelegene Schwann-Zellen charakterisiert, die sich um den Lateralliniennerv wickeln, wahrscheinlich durch einen Inhibitor der Wnt/β-Catenin-Signalisierung. 6,7,8. Während die Regulierung der INMC-Proliferation und Differenzierung in neue Neuromasten gut beschrieben wurde, wurden die Mechanismen, die das INMC-Nachwachsen nach Ablation regeln, nicht aufgeklärt. Dieses Protokoll dient als Mittel, um einzelne INMCs abzusprechen und ihr nachfolgendes regeneratives Verhalten zu analysieren.
Eine Vielzahl von Methoden zur Zerstörung von Haarzellen, unterstützenden Zellen und ganzen Neuromasten wurden veröffentlicht, zusammen mit Methoden zur Überwachung der Erholung. Chemische Ablation funktioniert gut für Haarzellen, aber Dosen von toxischen Chemikalien wie CuSO4 müssen deutlich erhöht werden, um andere laterale Linie Zelltypen9zu entfernen. Während die Elektroablation unter Fluoreszenzmikroskopie ein wirksames und einfaches Mittel zur Zerstörung von INMCs zur Untersuchung der Regeneration ist, ist es schwierig, eine enge Zielart zu sein und wird daher wahrscheinlich erhebliche Kollateralschäden verursachen. Dadurch können Aspekte von INMC-spezifischen Verhaltensweisen10,11maskiert werden. Laserablationsprotokolle wurden verwendet, aber sie erfordern den Einsatz von speziellen Geräten, die nicht unbedingt im durchschnittlichen Labor oder in der Bildgebungseinrichtung vorhanden sind (d. h. hochleistungsbetriebene gepulste UV-Laser12). Das hier beschriebene Verfahren kann mit jedem Laserscanning-Konfokalmikroskop durchgeführt werden, das mit dem gängigen 405 nm-Laser ausgestattet ist, der normalerweise für die Abbildung von DAPI und anderen blauen Fluorophoren verwendet wird. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass konfokale Bildgebung unmittelbar vor und nach einer Zellschädigung durchgeführt werden kann, ohne zusätzliche Lasersteuerungssysteme einzuschalten oder auf ein anderes Mikroskop zu übertragen, das mit einem gepulsten Laser ausgestattet ist.
Eine ähnliche Methode wurde beschrieben, um Neuronen im Zebrafisch Rückenmark13abzuleisten. Die vorherige Methode erfordert jedoch ein FRAP-Modul für die Zellablation, was für dieses Protokoll nicht erforderlich ist. Angesichts der unterschiedlichen Eigenschaften verschiedener Zelltypen (d. h. Helligkeit der Transgenfluoreszenz, Tiefe im Körper und Zellform) ist es wahrscheinlich, dass je nach verwendetem Zelltyp erhebliche Änderungen erforderlich sind. Das hier beschriebene Protokoll ist eher für oberflächlichere Zellen wirksam, wie durch eine Demonstration der sensorischen Haarzellablation mit der gleichen Methode unterstützt wird. Ebenfalls skizziert ist ein Regenerationstest zur Beurteilung der INMC-Rückgewinnungsraten nach ablation, der in der oben genannten Studie nicht enthalten war.
Das hier beschriebene laserbasierte Zellablationsprotokoll erfasst die Regenerationsfähigkeit von INMCs durch die Optimierung von Laserbedingungen, Vor- und Nachablationsbildgebung und Zeitraffermikroskopie. Diese Elemente kommen zusammen, um INMC-Nachwachsen und Lückenschluss umfassend darzustellen. Während dieses Protokoll hier verwendet wird, um INMCs zu zerstören, kann es auf andere Arbeiten angewendet werden, die eine zuverlässige und effektive Bewertung der zellulären Ablation erfordern. Es ist auch eine zugängliche Technologie, da es auf jedem konfokalen Mikroskop mit einem 405 nm Laser durchgeführt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll beschreibt eine vielseitige Methode zur Laserzellablation, die auf jedem konfokalen Mikroskop durchgeführt werden kann, das mit einem nahezu ultravioletten Laser (405 nm Wellenlänge) ausgestattet ist. Dieses Protokoll befasst sich mit Einschränkungen der zuvor eingesetzten Methoden wie Elektroablation (die weiter verbreitete Schäden verursacht11) und gepulste UV-Laserablation (die zusätzliche Spezialausrüstung erfordert12). Die konfokale Bildgebung vor und nach der Ablation gibt ein schnelles Feedback zum Erfolg des Experiments. Die nachfolgende Zeitraffermikroskopie bietet einen einfachen Test zur Regeneration in einem für die sensorische Systementwicklung kritischen Zelltyp.
Es ist von entscheidender Bedeutung, transgene Zebrafische, die GFP stark in Neuromasten und INMCs ausdrücken, vorzusieben. Larven mit heller Fluoreszenz und etwa gleichmäßigem Abstand der primI-abgeleiteten Neuromasten sind ideale Kandidaten für die Laserablation. Selbst bei diesen Fischen gibt es gelegentlich dimmer inMCs, die zunächst der Erkennung entgehen können. Diese Zellen können nach der Laserablation zurückbleiben und die Bildung einer echten Lücke zwischen INMCs verhindern. Der digitale Gain sollte so eingestellt werden, dass diese Dimmerzellen während der Vorablationsbildgebung so sichtbar werden, dass sie auch mit dem 405 nm Laser (Schritt 8.2) gezielt eingesetzt werden können.
In ähnlicher Weise zerstört Laser-Targeting manchmal nicht vollständig eine Zelle; vielmehr wird die Fluoreszenz bleichen, was dazu führt, dass keine wirkliche Lücke entsteht. Diese Zellen werden in der Regel die Fluoreszenz während der Zeitraffermikroskopie erhöhen. Gain-Anpassungen im Schritt der Bildgebung nach der Ablation zusammen mit der T-PMT-Bildgebung (Abbildung 2) tragen dazu bei, dass alle gezielten Zellen effektiv entfernt wurden. Häufig sind zwei oder drei einzelne Zellablationen erforderlich, um eine Lücke in der INMC-Zeichenfolge zu erzeugen. Der Zelltod kann durch Blessur oder ein körniges Aussehen in den Zielzellen nachgewiesen werden; obwohl dies eine kurze Wartezeit nach dem Laser-Targeting erfordern kann (und in einigen Fällen werden kurze Zeit später scheinbare apoptotische oder nekrotische Zahlen beobachtet).
Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es mehrere experimentelle Versuche erfordern kann, bevor die Laserbedingungen optimiert werden und die INMC-Regeneration erfolgreich ist. Die Laserleistung und die Gesamtverweilzeit des Lasers können jeweils eine leichte Anpassung für verschiedene Proben erfordern. Es wurde festgestellt, dass übermäßige Laseranwendung die Fähigkeit der Seitenlinie beeinträchtigen kann, sich selbst zu reparieren. Dazu gehören sowohl 1) Überbelichtung einzelner Zellen gegenüber Laserbestrahlung, die vermutlich zusätzliche Schäden an umgebenden Geweben verursacht, als auch 2) die Ablation zu vieler Zellen in der Schnur, was zu einer größeren Lücke führt. Die Benutzer müssen ein Gleichgewicht zwischen ausreichend bestrahlenden Zellen erreichen, um ihre Zerstörung zu gewährleisten, und nicht, die Zellen zu überbelichten, was die Regeneration verlangsamen oder verhindern kann. Mit den entsprechenden Einstellungen wurde festgestellt, dass die INMCs ohne sichtbare Beschädigung des hinteren seitlichen Liniennervs entfernt werden können, was darauf hinweist, dass Kollateralschäden mit diesem Protokoll im Gegensatz zur Elektroablation11minimiert werden. In keinem Fall bildeten sich neue Neuromasten in der Lücke, vermutlich weil der Lateralliniennerv intakt bleibt und die zugrunde liegenden Gliazellen erhalten bleiben und die Proliferation von INMCs6,7,8,11hemmen.
Es wird gezeigt, dass diese Methode der konfokalen Laserablation auch auf andere Zelltypen angewendet werden kann, insbesondere bei solchen, die sich oberflächlich innerhalb des Tieres befinden, einschließlich sensorischer Haarzellen (Abbildung 4). Ein ähnliches Protokoll kann verwendet werden, um Hautzellen abzuergänzen, um Wundreparatur oder Neuronen für axonale Regenerationsstudien zu untersuchen, wie zuvor beschrieben13. Es wird erwartet, dass diese Technik eine nützliche Ergänzung zum experimentellen Repertoire von Laboratorien werden wird, die ein konfokales Mikroskop besitzen, aber keine andere spezialisierte Ausrüstung für die Laserablation.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch nIH R15 Grant 1R15DC015352-01A1 und Pace University interne Finanzierungsquellen finanziert. Fischlinien wurden mit freundlicher Genehmigung von Vladimir Korzh14, Katie Kindt15,16, und das Labor von A. James Hudspeth. Wir danken A. James Hudspeth und Mitgliedern seiner Gruppe für das Feedback zu diesen Experimenten und kollegen kollegen von der Pace University für ihre Unterstützung. Die logistische Regressionsanalyse in RStudio wurde insbesondere von unserem Kollegen Matthew Aiello-Lammens unterstützt.
Materials
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
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