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Genetik

Identificazione dei contatti Enhancer-Promoter nei corpi embrionali mediante Quantitative Chromosoma Conformation Capture (4C)

Published: April 29, 2020
doi:
10.3791/60960
, , ,
1Center for Genomic Regulation (CRG),The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Universitat Pompeu Fabra, 3Vall d’Hebron Institute of Oncology

Summary

Segnaliamo l’applicazione della cattura della conformazione quantitativa del cromosoma seguita dal sequenziamento ad alto processo in corpi embrionali generati da cellule staminali embrionali. Questa tecnica consente di identificare e quantificare i contatti tra stimolatori e regioni promotrici di un determinato gene durante la differenziazione delle cellule staminali embrionali.

Abstract

Durante lo sviluppo dei mammiferi, i destini cellulari sono determinati attraverso la creazione di reti regolatorie che definiscono la specificità, la tempistica e i modelli spaziali dell’espressione genica. I corpi embrionali (EB) derivati dalle cellule staminali pluripotenti sono stati un modello popolare per studiare la differenziazione dei principali tre strati germinali e per definire i circuiti regolatori durante la specifica del destino cellulare. Anche se è ben noto che gli stimolatori specifici dei tessuti svolgono un ruolo importante in queste reti interagendo con i promotori, assegnarli ai loro geni bersaglio rilevanti rimane ancora impegnativo. Per rendere possibile tutto ciò, sono necessari approcci quantitativi per studiare i contatti potenziatori-promotori e le loro dinamiche durante lo sviluppo. Qui, abbiamo adattato un metodo 4C per definire gli esaltatori e i loro contatti con i promotori di cognati nel modello di differenziazione EB. Il metodo utilizza spesso enzimi di restrizione di taglio, sonicazione e un protocollo PCR mediato con la legatura nidificata compatibile con i kit di preparazione della libreria del DNA commerciale. Successivamente, le librerie 4C sono sottoposte a sequenziamento ad alto contenuto di velocità e analizzate in modo bioinformatico, consentendo il rilevamento e la quantificazione di tutte le sequenze che hanno contatti con un promotore scelto. I dati di sequenziamento risultanti possono essere utilizzati anche per ottenere informazioni sulle dinamiche dei contatti enhancer-promotore durante la differenziazione. La tecnica descritta per il modello di differenziazione EB è facile da implementare.

Introduction

Nei topi, la massa cellulare interna (ICM) di embrioni di 3,5 giorni contiene cellule staminali pluripotenti embrionali. L’ICM si sviluppa ulteriormente nell’epiblast al giorno 4.5, generando ectodermi, mesodermi ed cellule endodermiche, i principali tre strati germinali nell’embrione. Sebbene le cellule pluripotenti nell’ICM esistano solo in modo transitorio in vivo, possono essere catturate nella coltura dalla creazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC)1,2,3. I mESC rimangono in uno stato indifferenziato e proliferano a tempo indeterminato, ma su stimoli intrinseci ed estrinseci sono anche in grado di uscire dallo stato di pluripotenza e generare cellule dei tre strati germinali dello sviluppo2,4. È interessante notare che, quando coltivati in sospensione in piccole goccioline, le mESC formano aggregati tridimensionali (cioè EB) che si differenziano in tutti e tre gli strati germinali5. L’analisi della formazione EB è uno strumento importante per studiare il processo di specifica del lignaggio precoce.

Durante la specifica del lignaggio, le cellule di ogni strato germinale acquisiscono un programma di espressione genica specifico4. L’esatta espressione spatiotemporale dei geni è regolata da diversi elementi cis-regolatori, tra cui promotori di base, esaltatori, silenziatori e isolanti6,7,8,9.9 Stimolatori, segmenti di DNA regolatori in genere che abbracciano poche centinaia di coppie di basi, coordinano l’espressione genica specifica del tessuto8. Gli esaltatori sono attivati o silenziati mediante il legame di fattori di trascrizione e cofattori che regolano la struttura della cromatina locale8,10. Le tecniche comunemente usate per identificare gli stimolatori sono l’immunoprecipitazioni di cromatina a livello di genoma, seguita dal sequenziamento (ChIP-seq) e il test per la cromatina accessibile alla trasposta utilizzando tecniche di sequenziamento (ATAC-seq). Così, esaltatori attivi sono caratterizzati da specifici segni itoni attivi e da una maggiore accessibilità del DNA locale11,12,13,14. Inoltre, si ritiene che gli esaltatori dello sviluppo richiedano l’interazione fisica con il loro promotore di cognato8,9. Infatti, è stato dimostrato che le varianti e le delezioni dell’potenziatore che interrompono i contatti del promotore dell’avanzata possono portare a malformazioni dello sviluppo15. Pertanto, vi è la necessità di nuove tecniche che forniscano informazioni aggiuntive per l’identificazione dei potenziatori funzionali che controllano l’espressione genica dello sviluppo.

Dallo sviluppo della tecnica di cattura della conformazione cromosomica (3C)16, la mappatura dei contatti cromosomici è stata utilizzata in modo intensivo per valutare la distanza fisica tra gli elementi normativi. È importante sottolineare che di recente sono state sviluppate varianti ad alto contenuto di velocità effettiva di tecniche 3C, fornendo diverse strategie per la fissazione, la digestione, la legatura e il recupero dei contatti tra frammenti di cromatina17. Tra questi, in situ Hi-C è diventata una tecnica popolare permettendo il sequenziamento di prodotti di ligazione 3C genome-wide18. Tuttavia, gli elevati costi di sequenziamento necessari per raggiungere una risoluzione idonea per l’analisi dei contatti enhancer-promotore rende questa tecnica poco pratica per lo studio di loci specifici. Pertanto, sono stati sviluppati metodi alternativi per analizzare i loci mirati ad alta risoluzione19,20,21,22. Uno di questi metodi, vale a dire 4C, noto come uno contro tutta la strategia, consente il rilevamento di tutte le sequenze che contattano un sito selezionato come punto di vista. Tuttavia, uno svantaggio della tecnica standard 4C è la PCR inversa richiesta, che amplifica frammenti di dimensioni diverse, favorendo i piccoli prodotti e la quantificazione di biasimata dopo il sequenziamento ad alto throughput. Recentemente, UMI-4C, è stata sviluppata una nuova variante della tecnica 4C che utilizza identificatori molecolari univoci (UMI) per la profilazione quantitativa e mirata dei contatti cromosomici che aggira questo problema23. Questo approccio utilizza frese frequenti, sonicazione e un protocollo PCR mediato con legatura nidificata, che comporta così l’amplificazione di frammenti di DNA con una distribuzione della lunghezza relativamente uniforme. Questa omogeneità riduce le distorsioni nel processo di amplificazione delle preferenze PCR per sequenze più brevi e consente un recupero efficiente e un conteggio accurato delle molecole/frammenti collegati spazialmente.

Qui descriviamo un protocollo che adatta la tecnica UMI-4C per identificare e quantificare i contatti della cromatina tra promotori e stimolatori dei fattori di trascrizione istruttivi del lignaggio durante la differenziazione EB.

Protocol

1. Generazione di corpi embrionali da cellule staminali embrionali di topo Preparare il mezzo di coltura senza siero mESC: DMEM/F12 e mezzo neurobasale mescolati a un rapporto di 1:1. Il mezzo di coltura è integrato con MEM soluzione di amminoacidi non essenziali (1x), pyruvate di sodio (1 mM), L-glutamina (2 mM), penicillina-streptomycin (100 U/mL), beta-mercaptoe integratori a cui la parte (50 M), N2 e B27 (1x), PD0325901 (1 M), CHIR99021 (3 M) e il fattore inibitorio della leucemia (LIF) (1.000 U/mL). Preparare il mezzo di differenziazione EB: DMEM integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), MEM acidi non essenziali (1x), pironevate di sodio (1 mM), L-glutamina (2 mM), penicillina-streptomica (100 U/mL), beta-mercapethanol (50 mM). Coltura mESC su 10 cm piatti di plastica prerivestiti con 0.1% (w/v) gelatina in mESC coltura senza siero. Quando gli mESC raggiungono il 60% di confluenza, rimuovete il mezzo di coltura e lavate delicatamente 1x con 2 mL di PBS sterilizzato. Rimuovere completamente PBS e aggiungere 2 mL di mezzo di stacco cellulare. Incubare il piatto di coltura a 37 gradi centigradi per 5 min. Disattivare la reazione aggiungendo 8 mL di mezzo di differenziazione EB nel piatto. Dissociare le colonie di mESC pipetting su e giù 15-20 volte per ottenere una sospensione a singola cella. Centrifugare le cellule a 300 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min e rimuovere con attenzione il supernatante. Contare le cellule (ad esempio, utilizzando un emocitometro). Risospendere il pellet cellulare con il mezzo di differenziazione EB e regolare la concentrazione a 2 x 104 celle/mL. Invertire il coperchio di un piatto di coltura di 15 cm e utilizzare una pipetta multicanale da 200 l per depositare 20 gocce di celle risospese (400 celle/goccia) sul coperchio. Invertire il coperchio con cura sulla camera inferiore e incubare il piatto con gocce appese a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 e 95% di umidità per 3 giorni. Raccogliere gli EB lavando delicatamente il coperchio con 10 mL di PBS e trasferire le sospensioni contenenti EB in un tubo di plastica da 50 mL. Posizionare il tubo a RT per 30 min, in modo che gli EB affonderanno sul fondo per gravità. Rimuovere con attenzione il super-natante. Risospendere delicatamente gli EB con 10 mL di mezzo di differenziazione EB fresco e trasferirli in una parabola Petri batteriologica di 10 cm. Controllare la formazione di EB 3-6 giorni dopo utilizzando un microscopio invertito. Le eB generate devono essere di dimensioni rotonde e omogenee. Incubare le colture a 37 gradi centigradi con un 5% di CO2 e 95% di umidità. Gli EB continueranno a differenziarsi nei tre strati germinali e potranno essere raccolti in vari momenti di analisi. 2. Dissociazione degli EB Raccogliere gli EB da due a tre piatti da 10 cm in un tubo di plastica da 50 ml. Centrifugare gli EB a 300 x g a RT per 5 min, quindi rimuovere con attenzione il supernatante. Risospendere gli EB con 10 mL di PBS. Centrifuga EBs a 300 x g a RT per 3 min e rimuovere il supernatante. Aggiungere 2 mL di trypsin-EDTA (0,25%) al pellet e incubare il tubo a 37 gradi centigradi per 15 min. Pipette su e giù ogni 3 minuti per ottenere una sospensione a cella singola. Aggiungere 8 mL di mezzo di differenziazione EB per arrestare la reazione trypsin. Controllare la dissociazione EB al microscopio e contare le cellule. 3. Fissazione Risospendere le cellule nel mezzo di coltura EB fresco a 1 x 106 cellule / mL. Per un tubo da 50 mL, utilizzare un massimo di 4,5 x 107 celle in 45 mL di mezzo. Aggiungere la paraformaldeide da uno stock del 37% (non più vecchio di 6 mesi) a una concentrazione finale dell’1%.AVVISO: Seguire le adeguate norme di salute e sicurezza durante la manipolazione della paraformaldeide perché è una sostanza chimica pericolosa. Incubare per 10 min a RT a rotazione. Quench formaldeide con l’aggiunta di glicina ad una concentrazione finale di 0.125 M. Incubare per 5 min a RT a rotazione. Trasferire le celle fisse sul ghiaccio e mantenere freddo a 4 gradi centigradi d’ora in poi. Pellere le cellule a 300 x g per 5 min in una centrifuga refrigerata. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet a freddo PBS (1 mL per 5 x 106 celle), quindi trasferire a 1,5 mL tubi di blocco sicuro. Pellet le cellule a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatante, e bloccare i pellet in azoto liquido. Memorizzare a -80 gradi centigradi o procedere con il protocollo riportato di seguito. 4. Lalisi cellulare e la digestione enzimatica di restrizione Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 0,25 mL di cuscinetto di lisi fredda di ghiaccio appena preparato (10 mM Tris-HCl pH : 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA630 e 1x inibitori proteasi) per 2-5 x 106 cellule. Per preparare 5 mL di buffer di lisi, vedere la tabella 1. Incubare le cellule per 15 min sul ghiaccio. Centrifuga a 1.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e tenere il pellet, che contiene i nuclei. Lavare i nuclei pelleta con 500 luna di lisi fredda tampone. Risospendere delicatamente il pellet in un tubo da 1,5 mL con 50 Gradi L di 0,5% di SDS nel buffer 1x 2, quindi incubare il tubo in un blocco di riscaldamento a 62 gradi centigradi per 10 min. Togliere i tubi dal blocco di riscaldamento e aggiungere 170 lofile di tampone di digestione contenente 25 – L di 10% triton X-100 per dissetare la SDS. Mescolare bene pipettando, evitando schiuma eccessiva. Incubare a 37 gradi centigradi per 15 min. Aggiungere 25 l di buffer di digestione, mescolare invertendo, e prendere 8 l come un controllo non digerito. Mantenere il campione di controllo non digerito a -20 . Aggiungere 100 Enzimi di restrizione U MboI (4 gradi di uno stock di 25 U/L) ai nuclei rimanenti e digerire la cromatina per 2 h a 37 gradi centigradi a rotazione. Aggiungere un’altra aliquota di 100 U di MboI e incubare per altri 2 h. Aggiungere altri 100 U di MboI e incubare a rotazione durante la notte a 37 gradi centigradi. Il giorno successivo, aggiungere altri 100 U di MboI e incubare per 3 h a 37 gradi centigradi a rotazione. Prendere 8 -L come campione di controllo digerito. De-crosslink campioni di controllo digerito e i campioni di controllo non digerito dal passo 4.8 aggiungendo 80 L di tampone TE (10 mM Tris pH , 8, 1 mM EDTA) e 10 -L di proteinae K (10 mg/mL). Incubare a 65 gradi centigradi per 1 ora. Eseguire 20 aliquote su un gel dello 0,6% per verificare l’efficienza della digestione. Le digestione riuscite mostrano per lo più frammenti nell’intervallo di 3,0-0,5 kb. 5. Legatura di prossimità e inversione del collegamento incrociato Incubare i campioni di MboI-digested a 65 gradi centigradi in un blocco di riscaldamento per 20 minuti per inattivare MboI, quindi raffreddare a RT. Centrifugare i tubi per 5 min a 1.000 x g a RT, rimuovere il supernatante e sciogliere il pellet in 200 . Aggiungere 1.000 l della miscela master di legatura ad ogni campione. Per preparare 1.000 l del mix master di legatura, vedere tabella 2. Mescolare invertendo e incubando a RT durante la notte con rotazione lenta (9 giri). Eliminare i residui di RNA e proteine aggiungendo 100 l di proteineassi K (10 mg/mL) e 10 -L di RNase A (10 mg/mL). Incubare campioni a 55 gradi centigradi per 45-60 min. Proseguire con i campioni di incubazione a 65 gradi centigradi per altre 4 h. 6. tosatura del DNA e selezione delle dimensioni Tubi freddi a RT. Centrifuga per 5 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi. Dividere il campione in tre tubi da 400 l in tubi da 2 mL e aggiungere 2 luna di glicogeno (20 mg/m), 40 l di acetato di sodio (3 M, pH e 5,2) e 2,5 x volumi (1 mL) del 100% di etanolo per ogni tubo. Mescolare invertendo e incubando a -80 gradi centigradi per 45-60 min. Centrifuga a 16.000 x g a 4 gradi centigradi per 25 min. Mantenere i tubi sul ghiaccio dopo la filatura e rimuovere con attenzione il supernatante con la pipettatura. Lavare i pellet di DNA risuspendendo in 800 : L del 70% di etanolo. Centrifuga a 16.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Rimuovere il supernatante ed eseguire il lavaggio ancora una volta con 800 luna di 70% di etanolo. Sciogliere il pellet in 130 gradi l di 1x di tampone Tris (10 mMM Tris-HCl, pH – 8) e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min per sciogliere completamente il DNA. Se necessario, utilizzare il pipettaggio per risospendere qualsiasi precipitare. Misurare la resa del DNA; 2,5-5 g di cromatina ci si può aspettare per 1 x 106 cellule. Controllare la legatura eseguendo 200 ng del prodotto 3C su un gel di agarose 0.6%. Legature di successo mostrano per lo più frammenti di DNA > 3 kb. Conservare i campioni a -20 gradi centigradi. Diluire un campione in un tubo da 0,65 mL adatto per la sonicazione a 10 ng/L in 100 -L di 1x volume di buffer Tris (1 g per tubo). La quantità standard utilizzata per la preparazione della libreria è di 3 g, quindi eseguire la sonicazione in tre tubi separati, se necessario. Inclinare il DNA a una dimensione di 150-700 bp (media 400-500 bp) utilizzando i seguenti parametri sul sonicatore: Cicli: 6-8 di 20 s su -60 s off. Questo dovrebbe rendere il DNA adatto per la preparazione della libreria di sequenziamento ad alto valore di velocità utilizzando I sequencer. Trasferire il DNA trasato in un normale nuovo tubo di sicurezza. Raggruppare più sonicazioni dello stesso campione. Riscaldare una bottiglia di perline di purificazione del DNA a RT. D’ora in eora, usa suggerimenti per l’associazione bassa. Aggiungere 1,8 volte volumi di perline al tubo di DNA e risospendere delicatamente. Incubare a RT per 5 min. Raccogliere le perline con un rack magnetico. Lavare le perline 2x con 1 mL di etanolo appena preparato 80% mantenendo i tubi nel rack magnetico.NOTA: rimuovere tutto l’etanolo, incluse le goccioline residue. Asciugare all’aria brevemente le perline (2-3 min) alla RT.NOTA: Non asciugare perline più lunghe di 5 min. Questo diminuirà la resa del DNA. Risospendere le perline con 90 : L di 1x Buffer Tris (10 mM Tris-HCl, pH – 8) per eluire il DNA. Misurare la resa del DNA e analizzare un 5 L L su un gel 1.5%. Ci dovrebbe essere una perdita molto scarsa rispetto al rendimento della presanicazione. 7. Preparazione della biblioteca per il sequenziamento Aggiungere 15 -L di master mix dal kit di preparazione della libreria. Per riparare le estremità del DNA trasciato, combinare 10 : L di 10x end repair reaction buffer e 5 -L di mix di enzimi di riparazione finale. Incubare a RT per 30 min. Aggiungere 1,1 volte di volume di perline di purificazione del DNA e rispendere delicatamente. Incubare a RT per 5 min. Raccogliere le perline con un rack magnetico. Lavare le perline due volte con 1 mL di etanolo appena preparato 80% mantenendo i tubi nel rack magnetico. Rimuovere l’etanolo. Asciugare all’aria le perline per 2-3 min a RT. Risospendere le perline con 42 . Aggiungete 8 l di miscela master a coda dA ad ogni campione. Per preparare il master mix dA-tailing, unire 5 L L di 10x buffer di reazione dA-tailing e 3 -L di Klenow frammento exo minus. Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min. Aggiungere 2 vitelli intestinali fosfoforesi (CIP) per deforograre il DNA. Incubare per 30 min a 37 gradi centigradi, quindi 60 min a 50 gradi centigradi. Aggiungere 1,1 x volumi di perline di purificazione del DNA e risospendere delicatamente. Incubare a RT per 5 min. Raccogliere le perline con un rack magnetico. Lavare le perline 2x con 1 mL di etanolo appena preparato 80% mantenendo i tubi nel rack magnetico. Asciugare all’aria le perline per un breve periodo (2-3 min) a RT. Resuspend perline con 35 .L di 1x Tris buffer (10 mM)Tris-HCl, pH – 8) per eluire il DNA. Eseguire la reazione di legatura dell’adattatore. Utilizzare le concentrazioni ridotte di adattatori/ligase come indicato nella tabella 3. Incubare a 20 gradi centigradi per 15 min. Aggiungete 3-L della miscela di glicosilil dna e lisciase del DNA liscino ndonte viI (ad esempio, USER), mescolare per pipettaggio e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min. Aumentare il volume a 100 gradi con acqua, far bollire 5 min a 96 gradi centigradi, quindi tenere i campioni sul ghiaccio. Aggiungere 1,1 x volumi di perline di purificazione del DNA e risospendere delicatamente. Incubare a RT per 5 min. Raccogliere le perline con un rack magnetico. Lavare le perline 2x con 1 mL di etanolo appena preparato 80% mantenendo i tubi nel rack magnetico. Asciugare all’aria le perline per 2-3 min a RT. Risospendere le perline con 50 .L di 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH – 8) per eluire il DNA. 8. 4C cromatina libreria di interazione amplificazione e purificazione Amplificare la libreria 4C utilizzando 10 l di libreria per effettuare il primo PCR. L’installazione e il programma PCR sono disponibili nella tabella 4. Eseguire PCR nidificato. L’installazione e il programma PCR nidificati sono disponibili nella tabella 5. Raggruppa i prodotti PCR per ogni libreria e purifica con una perla di purificazione del DNA 1.1x. Misurare la resa del DNA e analizzare un 5 L- aliquota su un gel 1.5%. Regolare la concentrazione della libreria e sequenziare la libreria. Se indicizzate, è possibile raggruppare in pool le librerie prima della sequenza.

Representative Results

Sei giorni dopo l’induzione della differenziazione eSC nelle cadute appese, abbiamo ottenuto una popolazione omogenea di EB che sono stati utilizzati per ulteriori analisi (Figura 1). Abbiamo adattato il metodo UMI-4C23 per quantificare l’interazione specifica della cromatina a favore dei promotori di geni specifici del lignaggio inEB 24. Nella pagina 2Aè illustrata una panoramica schematica del protocollo con gel di controllo qualità rappresentativi a diverse fasi. Il primo controllo di qualità è stato effettuato per determinare l’efficienza della digestione degli enzimi di restrizione MboI. La digestione efficiente ha mostrato una dimensione del frammento inferiore a 3 kbp (Figura 2B). Da notare che la digestione della cromatina mESC ed EB era difficile e talvolta residua cromatina non digerita persisteva. Il secondo controllo di qualità è stato effettuato dopo la legatura per verificare che la maggior parte dei frammenti erano ora > 3 kbp (Figura 2B). Quindi, i frammenti di cromatina ottenuti dopo la sonicazione sono stati analizzati dall’elettroforesi gel. Dimensioni dei frammenti di 400-500 bp erano attese (Figura 2B). Dopo la sforosforalazione e la legatura dell’adattatore monofinale, sono stati eseguiti due cicli di PCR per amplificare gli obiettivi di interesse. Un approccio nidificato è stato utilizzato per progettare un set di due primer per ogni locus. Ciò ha contribuito a migliorare la specificità. Ogni obiettivo è stato amplificato separatamente con due diverse coppie di primer per ottimizzare le condizioni PCR (cioè le coppie primer A e B per le coppie Pou5f1 e primer C e D per il locus T, rispettivamente) e ha provocato uno striscio di DNA intorno a 400 bp (Figura 2C). In alternativa, la PCR multiplex è stata eseguita per amplificare contemporaneamente gli obiettivi A e C (Figura 2D) e ha prodotto una dimensione di frammento simile dopo la purificazione (Figura 2D). I primer utilizzati per la preparazione della biblioteca 4C (loci di Pou5f1 e T) sono disponibili nella tabella 6. Per l’analisi dei dati, le letture di sequenziamento grezzo sono state prima allineate al genoma del topo refence mm10, sono state tutte duplicate e le letture di bassa qualità (< 20) sono state rimosse. Per ogni esca, le informazioni su ogni frammento di restrizione sono state ottenute calcolando il numero di frammenti letti ed è stato ottenuto un profilo di contatto non elaborato. Successivamente, la regione di interesse è stata definita come tutti i frammenti di restrizione con 2 kbp e 250 kbp di distanza dall'esca. La dimensione di ogni frammento di restrizione è stata aumentata aggregando i frammenti di restrizione adiacenti in sequenza per attenuare i profili fino a raggiungere una soglia del 5% del numero totale di contatti non elaborati nell'area di interesse. Per garantire che le repliche fossero integrate e che le condizioni fossero confrontate, abbiamo incluso sia pendenze che intercettazioni casuali a livello di frammento di restrizione. Il profilo medio per condizione e il cambio di piega tra di essi sono stati tracciati come illustrato nella Figura 3. Durante la differenziazione EB, i contatti tra gli potenziatori e il promotore del gene pluripotenza Pou5f1 sono diminuiti, mentre i contatti potenziatori-promotori del fattore di trascrizione istruttivo di derivazione ndoderm T sono aumentati (Figura 3),fornendo informazioni funzionali su questi potenziatori dello sviluppo. Figura 1: Immagini rappresentative di mESC e corpi embrionali derivati. Giorno 0 mESC coltivato in condizioni prive di siero (sinistra) e giorno omogeneo 6 EB (a destra) osservato da un microscopio invertito. Barra di scala : 500 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: flusso di lavoro 4C e immagini rappresentative dei passaggi principali del protocollo. (A) Flusso di lavoro schematico del quantitativo 4C. RS – sito di restrizione; Stati Uniti – a monte; DS – a valle; UP – primer universale; D – la distanza tra RS e DS dovrebbe idealmente essere 5-15 bp. (B) Esempi di cromatina digerita MboI (I), cromatina ligata in-nuclei (II) e cromatina sonicata (III). I numeri a sinistra indicano le dimensioni del DNA determinate dalla corsa della scala del DNA per ogni campione. (C) Esempi di amplificazione PCR nei due loci: Pou5f1 (primers A e B) e T (primer C e D). (D) Esempi di amplificazione PCR multiplex a Pou5f1 e T loci utilizzando primer A e C. ES – cellule staminali embrionali; EB – corpi embrionali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Esempi di profili 4C. Quantitative 4C profili per esche situati sui promotori genici Pou5f1 e T sputati in mESC e Day 6 EBS. Il pannello superiore mostra i grafici dei contatti medi generati da due repliche biologiche indipendenti; il pannello inferiore mostra il cambio di contatto medio degli EB del giorno 6 rispetto ai mESC (media delle due repliche). Le caselle azzurre indicano la posizione degli esaltatori con cambiamenti dinamici durante la differenziazione. Figura adattata da Tian etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Per 5mL 1M Tris-HCl, pH8.0 50 ll 5M NaCl 10 ll 10% Igepal CA630 100 ll 50x Roche inibitori completi della proteasi 100 ll Acqua MilliQ 4,74 mL Tabella 1: buffer di lisi. Per 1000 -L Acqua MilliQ 869 lL 10X NEB T4 DNA Ligase Buffer 120 l Albumina del siero bovino bovino 20mg/mL 6 ll 2000 U/L T4 DNA Ligase 5 ll Tabella 2: Preparazione del mix master di ligazione. Per 15 5X Buffer di reazione alla ligazione rapida 10 ll Adattatore NEBNext 3 l l Ligase di DNA T4 veloce 2 ll Tabella 3: Reazione di legatura dell’adattatore. Configurazione PCR Adattatore ligated library-on-deads 10 ll Acqua di grado PCR 20,25 ll 10M Primer specifico del bersaglio 3,75 l 10 – Molle dell’indice NEB 3,75 l Buffer Herculase II 5X 10 ll 10 Mm dNTP 1,25 l Ipcolasi II polimerasi 1 ll Volume totale 50 ll Programma PCR Fase 1: 98 gradi C – 2 min Fase 2: 98 gradi centigradi – 20 Fase 3: 65 gradi centigradi – 30 Fase 4: 72 gradi centigradi – 45s Passo 5: andare al passaggio 2 per fare un totale di 15-18 cicli Passo 6: 72 c – 3 min Passo 7: 4 gradi centigradi – tenere premuto Tabella 4: 4C cromatina interazione libreria amplificazione, primo PCR. Configurazione PCR annidata Frammento di DNA dal primo PCR 10 ll Acqua di grado PCR 20,25 ll 10 – M specifico primer Illuminar 3,75 l 10 -M P7 Illumina primer 3,75 l Buffer Herculase II 5X 10 ll 10 Mm dNTP 1,25 l Ipcolasi II polimerasi 1 ll Volume totale 50 ll Programma PCR nidificato Fase 1: 98 gradi C – 2 min Fase 2: 98 gradi centigradi – 20 Fase 3: 65 gradi centigradi – 30 Fase 4: 72 gradi centigradi – 45s Passo 5: andare al passaggio 2 per fare un totale di 15-18 cicli Passo 6: 72 c – 3 min Passo 7: 4 gradi centigradi – tenere premuto Tabella 5: amplificazione della libreria di interazione della cromatina 4C, PCR nidificato. Nome Sequenza (5′-3′) DS-Oct4-A AATGATACGGCACCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTACACGAGCTCTCTCTCTCTCTCTAAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG Stati Uniti-Ottobre4-A TCTCTCTCTAAGATAACTAGCACCAGGCC DS-Oct4-B AATGATACGGCACCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTACACGAGCTCTCTCTCTCTGGGGGGGGGGGGGGGGGACCGCT Stati Uniti-Ottobre4-B ACCAGGGGGGGGGGGGCAGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG DS-T-C AATGATACGGCACCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTACACGAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGCACGCAGCCAAGGAGAGAGA US-T-C GATTACACCTGGGTCCGCACATCGCCAA DS-T-D AATGATACGGCACCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTACACGAGCTCTCTCTCTGGGGCTTGGAGAGGTCAAGAGACCCGGGAG US-T-D GCTGAGGCTTTGGAGGCAGCAAGGAGACCACC UP-4C CAAGCAGAGaAGAGGCATACGA Adap-i1 CAAGCAGAGAGACGGCATACGAGAGTGGGACTGGGGGGGGGGAGTTCAGACGTGTGCTCTCTGAGATC Adap-i2 CAAGCAGAGAAGAGGCATACGAGACATCGGTGAGTTCAGACGTGTGCTCTCTGAGATC Adap-i3 CAAGCAGAGAAGACGGCATACGAGACTGCAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTCTGAGATC Adap-i4 CAAGCAGAGAGACGGCATACGAATTGCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTCTGAGATC Tabella 6: Primers utilizzati per la preparazione della libreria 4C.

Discussion

Il metodo di coltura della caduta sospesa non ha bisogno di ulteriori fattori di crescita o citochine e genera riproducibilmente popolazioni omogenee di EB da un numero predeterminato di mESC5. Qui descriviamo un protocollo di quantitative 4C adattato dall’approccio UMI-4C per quantificare il contatto enhancer-promotore dei fattori di trascrizione specifici del lignaggio nel modello di differenziazione EB. Abbiamo identificato le regioni della cromatina che contattano i promotori dei geni Pou5f1 e T in modo dinamico durante la differenziazione EB. Pou5f1 è stato regolato durante la differenziazione EB e la frequenza di contatto tra il promotore Pou5f1 e il suo potenziatore distale è diminuita. Al contrario, T è stato regolato durante la differenziazione EB e abbiamo identificato tre stimolatori per i quali le frequenze di contatto con il loro promotore sono diminuite (Figura 3). Per confermare l’identificazione, un’immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP) di marchio istorio attivo H3K27ac può essere eseguita24, in quanto questo segno istono è stato dimostrato essere associato con l’attivazione potenziatore e stimolatori perdere questo marchio durante la loro inattivazione11.

Una tecnica standard 4C è stata ampiamente utilizzata per esaminare il profilo di contatto della cromatina di specifici siti genomici25. Tuttavia, questo approccio è difficile da interpretare quantitativamente anche dopo un’ampia normalizzazione26,27,28 a causa delle distorsioni introdotte dall’eterogeneità delle dimensioni dei frammenti PCR e dall’impossibilità di distinguere i duplicati PCR. Il nostro metodo quantitativo 4C è in gran parte identico alla tecnica UMI-4C che consente la quantificazione di singole molecole utilizzando la sonicazione e un passo PCR mediato a legatura nidificata per aggirare la limitazione del classico approccio 4C23. Tuttavia, a differenza dell’UMI-4C che utilizza identificatori molecolari univoci, il nostro protocollo quantitativo 4C consente la quantificazione di singole molecole in base alla rottura specifica del DNA prodotta dalla fase di sonicazione. Rende il nostro protocollo compatibile con i kit di preparazione della libreria del DNA commerciale, eliminando la necessità di primer con identificatori molecolari unici.

Il nostro protocollo prevede diversi passaggi chiave che dovrebbero essere considerati. Come nel metodo 4C classico28, fattori critici del nostro protocollo sono l’efficienza della digestione e la legatura durante la preparazione delle molecole 3C. Basse efficienze di digestione/legamento possono ridurre drasticamente la complessità dell’interazione con un frammento di interesse, con conseguente riduzione della risoluzione. Come descritto in precedenza23, un altro passaggio critico del protocollo è la progettazione dei primer per l’amplificazione della libreria. I secondi primer di reazione PCR dovrebbero trovarsi a 5-15 nt dal sito di restrizione interrogatorio. In una lettura di sequenza 75 nt, ciò consente di almeno 40 nt a sinistra della lunghezza di acquisizione per il mapping. Il primer utilizzato nella prima reazione PCR deve essere progettato a monte del secondo primer senza sovrapposizioni ed entrambi dovrebbero essere sufficientemente specifici da garantire un’amplificazione efficiente del DNA. Per il multiplexing, i primer devono essere progettati in modo indipendente, puntando a una temperatura di fusione (Tm)di 60-65 gradi centigradi. Inoltre, come per altre tecniche 3C, la risoluzione del metodo quantitativo 4C è determinata dall’enzima di restrizione utilizzato nel protocollo25. Questo protocollo utilizza un enzima di restrizione con un sito di riconoscimento di 4 bp, MboI. La risoluzione massima con questo enzima è di circa 500 bp, ma questo è altamente dipendente dal locus e raramente raggiunto. Un’altra limitazione è che le interazioni che si verificano tra gli elementi che si trovano nello stesso frammento di restrizione non sono rilevabili. Inoltre, le interazioni che si verificano a una distanza di un sito di restrizione non possono essere distinte dallo sfondo non digerito. L’uso di un passaggio di riempimento prima della legatura potrebbe consentire il rilevamento di queste interazioni.

Quantitative 4C è ideale per interrogare i contatti della cromatina di loci mirati. Tuttavia, la fase specifica di amplificazione PCR limita il numero di loci che possono essere studiati contemporaneamente. Un modo per aumentare il numero di loci mirati è quello di multiplex passaggi PCR per amplificare contemporaneamente diversi obiettivi, ma questo richiede la compatibilità dei primer utilizzati e testare ogni coppia di primer prima dell’implementazione. Se si desiderano cambiamenti globali dell’architettura della cromatina nei promotori, approcci a livello di genoma come Hi-C, PC Hi-C o HiChIP sarebbero più appropriati29,30,31.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo F. Le Dily, R. Stadhouders e i membri del laboratorio Graf per i loro consigli e discussioni. G.S. è stata sostenuta da una borsa di studio Marie Sklodowska-Curie (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T da una borsa di studio post-dottorato Juan de la Cierva (MINECO, FJCI-2014-22946). Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca nell’ambito del7th Framework Programme FP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome, accordo 609989 a T.G.), del Ministero spagnolo dell’economia, dell’industria e della competitività (MEIC) al partenariato EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 e del programma CERCA Generalitat de Catalunya.

Materials

0.1% EmbryoMax gelatin EMD Millipore ES-006-B Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA 25200072
AMPure XP Beckman Coulter 10136224 4C/DNA purification
B27 supplement Gibco 17504044 Cell culture
Beta-mercaptoethanol Gibco 31350010 Cell culture
Bioruptor Pico Diagencode B01060010 4C/sonication
BSA NEB B9000S 4C
CHIR99021 Selleck Chemicals S1263 Cell culture
CIP NEB M0212 4C
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001 4C
DMEM/F12 medium Gibco 11320033 Cell culture
dNTP NEB N0447S 4C
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1107 Cell culture
Formaldehyde solution (37%) Sigma 252549-25ML 4C
Glycin Sigma GE17-1323-01 4C
Glycogen ThermoFischer R0551 4C
Herculase II Fusion DNA polymerase Agilent 600675 4C
IGEPAL CA-630 Sigma I3021-50ML 4C
Knockout DMEM 10829018
L-glutamine Gibco 25030081 Cell culture
MboI NEB R0147M 4C
MEM non-essential amino acids Gibco 11140050 Cell culture
N2 supplement Gibco A1370701 Cell culture
NEBNext DNA Library prep NEB E6040 4C
NEBuffer 2.1 NEB B7202S 4C/digestion
Neurobasal medium Gibco 21103049 Cell culture
PD0325901 Selleck Chemicals S1036 Cell culture
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Proteinase K NEB P8107S 4C
Qubit 4 Fluorometer ThermoFischer Q33238 4C
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFischer Q32851 4C
RNase A ThermoFischer EN0531 4C
Sodium pyruvate solution Gibco 11360070 Cell culture
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 Cell culture
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S 4C
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB M0202M 4C
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Referenzen

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4CChromosome Conformation CaptureEnhancer-promoter ContactsEmbryoid BodiesMouse Embryonic Stem CellsGene RegulationCis-regulatory ElementsChromatin InteractionsCell CultureCell Differentiation

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Tian, T. V., Vidal, E., Graf, T., Stik, G. Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C). J. Vis. Exp. (158), e60960, doi:10.3791/60960 (2020).
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