Un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules
Summary
Le protocole présenté décrit une méthode pour un test d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité des composés de petites molécules.
Abstract
L’analyse d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité sont deux études principales qui peuvent être exécutées utilisant la méthode présentée ci-dessus. Ce protocole fournit une analyse fiable de la morphologie neuronale ainsi que des mesures quantitatives des modifications sur la longueur de la neurite et la localisation des protéines synaptiques et l’abondance lors du traitement avec de petits composés de molécules. En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité peut être effectuée pour évaluer, distinguer et classer les composés chimiques commerciaux en fonction de leur effet potentiel de neurotoxicité développementale.
Même si les lignées cellulaires sont aujourd’hui largement utilisées dans les tests de dépistage composés en neurosciences, elles diffèrent souvent génétiquement et phénotypiquement de leur origine tissulaire. Les cellules primaires, d’autre part, maintiennent des marqueurs et des fonctions importants observés in vivo. Par conséquent, en raison du potentiel de traduction et de la pertinence physiologique que ces cellules pourraient offrir l’essai de néoration et l’évaluation de neurotoxicité peuvent considérablement bénéficier de l’utilisation des cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) comme modèle cellulaire humain primaire.
La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.
Introduction
La croissance de la neurite est un processus fondamental pour la formation du réseau neuronal et la régénération nerveuse1,2. À la suite d’une blessure, l’excroissance de la neurite joue un rôle clé dans la régénération du système nerveux. L’excroissance de neurite est également un élément important de la signalisation extracellulaire en induisant des activités régénératrices neuronales pour améliorer les résultats pour les désordres neurodégénératifs et les dommages neuronaux3,4,5,6.
En maintenant leur potentiel de différenciation dans la production de diverses lignées neuronales, les cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) pourraient fournir un système modèle pour l’étude de la fonction et du développement du système nerveux central (SNC)7,8,9. Le potentiel translationnel élevé et la pertinence physiologique des HNPC en tant que modèle primaire de cellules humaines offrent un avantage considérable dans les dépistages de découverte de drogue liés à l’excroissance de neurite. Toutefois, l’entretien et l’échelle des modèles de cellules primaires pour les tests à haut débit pourraient prendre beaucoup de temps et10,11,12,13.
En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité est une autre application utilisant les neurones dérivés du HNPC. Il y a des milliers de composés chimiques commerciaux qui ne sont pas examinés ou avec un potentiel de neurotoxicité mal compris. Par conséquent, des expériences de dépistage plus fiables et plus efficaces pour évaluer, distinguer et classer les composés en fonction de leur potentiel pour susciter une neurotoxicité développementale sont très demandées14. L’augmentation de la prévalence et de l’incidence des troubles neurologiques ainsi que l’abondance de composés non testés dans l’environnement nécessite le développement d’expériences plus fiables et efficaces pour identifier les composés environnementaux dangereux qui peuvent poser la neurotoxicité15.
La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est l’un des rares articles publiés décrivant le test de longueur de neurite lors du traitement avec des composés d’essai. En outre, nous décrivons comment employer des hNPC pour un essai de neure de excroissance et évaluation de neurotoxicité. En utilisant cet essai d’excroissance de neure et l’évaluation de neurotoxicité sur les neurones dérivés des HNPC, le potentiel neurogénique d’une catégorie de composés épigénétiques à petites molécules, inhibiteurs du HDAC, dans l’induct…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par la subvention de recherche nimad (940714) accordée au CRG.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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