JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

Greft Kalite Değerlendirmesi için Kimyasal Biyopsi Kullanımı

Published: June 17, 2020
doi:
10.3791/60946
, , , , , , , , ,
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy,Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery,Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz,Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine,Toronto General Hospital

Summary

Protokol, transplantasyon için ayrılan böbrek greftlerinin kalite değerlendirmesi için kapsamlı metabolomik ve lipidomik analizler ile kimyasal biyopsi yaklaşımının kullanımını göstermektedir.

Abstract

Böbrek nakli, dünya çapında son dönem böbrek fonksiyon bozukluğu olan çok sayıda insan için hayat kurtarıcı bir tedaviyöntemidir. Prosedür konvansiyonel diyaliz ile karşılaştırıldığında artan sağkalım oranı ve hastanın yaşam kalitesinin daha yüksek ile ilişkilidir. Ne yazık ki, transplantoloji organ kalitesi değerlendirmesi için güvenilir yöntemlerin eksikliği muzdarip. Standart tanı teknikleri, greft hakkında kapsamlı bilgi vermeyen makroskopik görünüm muayenesi veya invaziv doku biyopsisi ile sınırlıdır. Önerilen protokol, transplantasyon için ayrılan böbreklerde bulunan tüm düşük moleküler bileşiklerin kapsamlı metabolomik ve lipidomik analizi için ideal bir analitik yöntem olarak katı faz mikroekstraksiyonunun (SPME) tanıtılmayı amaçlamaktadır. SPME sondasının küçük boyutu, metabolitlerin herhangi bir doku toplama olmadan doğrudan organdan çıkarılmasını sağlayan kimyasal biyopsi yapılmasını sağlar. Yöntemin minimum invazivliği zaman içinde birden fazla analizin gerçekleştirildirilmesine izin verir: organ hasadı ndan hemen sonra, korunması sırasında ve alıcının vücudunda revaskülarizasyondan hemen sonra. Bu yeni örnekleme yönteminin yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleşimi, greft kalitesinin biyolojik belirteçleri ve organ disfonksiyonunun olası gelişiminin göstergeleri olarak hizmet verebilecek bir dizi karakteristik bileşiğin ayrımcılığa izin verdiği varsayımında bulunmaktadır.

Introduction

ABD Organ Tedarik ve Transplantasyon Ağı’na göre, 2019 yılında ABD’de böbrek nakli bekleyen 94.756 hasta vardı; 2018 yılında Avrupa’da ise bu sayı 10.791 idi. Her on dakikada bir, birisi ABD’de ulusal organ nakli bekleme listesine eklenir, ve 20 kişi her gün bir organ nakli 1 bekliyor ölmek tahmin edilmektedir1,2. Böbrek nakli, dünya çapında son dönem böbrek fonksiyon bozukluğu yaşayan çok sayıda insan için hayat kurtarıcı bir tedaviyöntemidir. Prosedür konvansiyonel diyaliz ile karşılaştırıldığında artan sağkalım oranı ve daha yüksek yaşam kalitesi ile ilişkilidir.

Ancak organ nakli, organ yetersizliği veya organ kalitesinin değerlendirilmesi için etkili araçların olmaması gibi pek çok ciddi sorunla karşı karşıyadır. Standart protokoller, greftin kalitesi hakkında kapsamlı bilgi vermeyen makroskopik görünüm muayenesi veya invaziv doku biyopsisi ile sınırlıdır. Görsel bir değerlendirme göz de görülebilen tümörlerin belirlenmesine, anatomik anormalliklere veya greftlere büyük hasara olanak sağlarken, bu yaklaşım çok özneldir ve gözlemcilerin deneyimlerine göre etkinliğine göre değişiklik gösterir. Biyopsi ise önceden var olan böbrek hastalıkları ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilir ve bu nedenle greft sonuçlarının belirlenmesinde objektif ve kanıtlanmış bir değer yöntemi olarak kabul edilir. Ancak, biyopsi prosedürü kusurları ücretsiz değildir; kanama gibi potansiyel komplikasyonlar riski vardır ve soğuk iskemik süreyi önemli ölçüde uzatan 4-5 saatlik ek numune hazırlama gereklidir. Bu nedenle, özellikle Avrupa’da, doğrudan doku analizi kullanımı genişletilmiş kriterler donörler (ECD) ve3donörler dolaşım ölüm (DCD) 3,4sonra sınırlıdır.

Metabolomik ve lipidomik son zamanlarda organ korunması sırasında meydana gelen biyokimyasal yollar değişiklikleri daha iyi anlaşılması için umut verici yaklaşımlar olarak kabul edilmiştir. Metabolomik ve lipidomik profilleme sonraki sonuçları ile organ kaldırma ile ilgili ani çevresel değişikliklere sistemin acil tepkilerin izlenmesini sağlar: iskemi, oksidatif stres, veya inflamatuar yanıtlar5,6,7,8. Böbrek büyük ölçüde metabolik süreçler ile ilişkili bir organdır, böylece metabolitler ve lipid konsantrasyonları ölçümleri potansiyel organ kalitesi biyobelirteçleri belirlenmesine izin verebilir ve greft sonucu daha iyi tahminler sağlar.

Mevcut organ kalite değerlendirme yöntemleri ile ilişkili yukarıdaki komplikasyonlar ve sınırlamalar göz önüne alındığında, hızlı ve karmaşık organ kalite değerlendirmesi için daha az invaziv tanısal çözüm gereklidir. Solid faz mikroekstraksiyonu (SPME), geniş bir metabolit ve lipid spektrumunun kapsamasını sağlayan minimal invaziv bir analitik yöntem olarak bu gerekliliklere uygundur. Teknik ince (~ 200 μm), biyouyumlu, titanyum-nikel alaşım probu ince organ içine kısa bir süre için seçici bir ekstraksiyon fazı ile kaplı ekleme dayanmaktadır. SPME’nin protein ekstraksiyonunu önlediği ve bu nedenle alternatif yöntemlere göre önemli bir avantaj olan numune toplama aşamasında metabolizma inhibisyonunu sağladığı vurgulanmalıdır. Ayrıca,,cihazın minyatürleştirilmesi organ9,10,11birkaç yapıların tekrarlayan ve eşzamanlı analizlerin yürütülmesi için izin verir.11

Protocol

Tüm hayvanlar, Ulusal Tıbbi Araştırma Derneği tarafından formüle edilen ”Laboratuvar Hayvan Bakımı İlkeleri” ve Kanada’daki Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından yayınlanan ”Laboratuvar HayvanlarıNın Bakımı Kılavuzu” uyarınca insancıl bakım almıştır. Toronto Genel Araştırma Enstitüsü Hayvan Bakım Komitesi tüm çalışmaları onayladı. Araştırma insan denekler torun Bydgoszcz Nicolaus Copernicus Üniversitesi’nde Collegium Medicum Biyoetik Komitesi tarafından onaylandı dahil. NOT: Uygun etik kurullardan onay alın. Her zaman güvenlik eldiveni giymeyi unutmayın. SPME problarının çıkarma aşamasına dokunmayın. Lipidomik analizler için devre dışı cam şişelerin kullanılması önerilir. 1. Probların hazırlanması 7 mm karışım modu sorbent ile kaplanmış titanyum-nikel alaşım probları (40 mm uzunluk; 0,2 mm çapında) hazırlayın. Probların sayısı, tüm yordam sırasında hedeflenen zaman noktalarına ve çoğaltma sayısına bağlıdır (zaman başına 3 önerilir).NOT: Çıkarma aşamasının uzunluğu ve türü çalışma şekline, metabolitlerin polaritesine ve örnek matrisine göre ayarlanabilir. 2:1 kloroform:metanol (v/v) oluşan bir temizlik karışımı hazırlayın. Her 2,0 mL cam şişeye çözeltinin 1,0 mL’lik pipet’i ve her şişeye daha önce kapağı delmiş bir probu yerleştirin.NOT: Kullanmadan önce, kontamine partikülleri temizlemek için tüm probları temizleyin. Şişeleri ajitatöre koy ve ajitasyon hızını 1200 rpm olarak ayarla. 45 dakika sonra cihazı durdurun ve kaplamaları LC-MS sınıfı suyla durulayın. Kaplamalar onları etkinleştirmek için bir ön koşullandırma adımı geçmesi gerekir gibi, 1:1 metanol oluşan bir önkoşullandırma karışımı hazırlamak: su (v / v). Her 2,0 mL cam şişeye çözeltinin 1,0 mL’lik pipet’i ve her şişeye daha önce kapağı delmiş bir probu yerleştirin. Şişeleri girdap ajitatöre koyun ve ajitasyon hızını 1200 rpm olarak ayarlayın. 60 dakika sonra ajitörü durdurun ve kaplamaları LC-MS sınıfı suyla durulayın. Probları standart cerrahi ekipman sterilizasyon protokolüne göre sterilize edin. 2. Çıkarma Steril bir ortam sağlamak için örneklemeden hemen önce steril paketi açın. Her zaman noktasında 10 dakika boyunca doğrudan böbrek korteksine iki prob yerleştirin. Kaplamanın tüm uzunluğu doku matrisi ile kaplanmalıdır; belirli bir açı gereklidir, ancak ca. 90 deg genellikle kullanılır.NOT: Tüm tıbbi prosedür, belirli bir kurumdaki standart protokolleri izler. SPME örneklemesi ile ilgili hiçbir değişiklik dikkate alınmaz. Yordam aşağıdaki altı örnekleme zaman noktasını içerir:a) böbrek rezeksiyonu öncesi, donörden in vivo;b)-e) 1 saat, 3 h, 5 h, böbrek perfüzyonu 7 h sonra, organ odasında ex vivo;f) reperfüzyon sonra, alıcıdan in vivo. Sondaları dokudan çekerek geri çekin ve kaplama yüzeyinden kalan kanı temizlemek için lc-MS sınıfı su ile durulayın. Cerrahi bölgeden uzaklaşın ve sondaların çıkarılmasından hemen sonra. 3. Taşıma ve depolama Probları ayrı şişelere yerleştirin ve kapatın. Şişeleri kuru buzla dolu bir strafor kutusuna veya taşınması için sıvı nitrojene yerleştirin. Numuneleri bir dondurucuda (-80 °C) saklayın veya hemen desorption adımına başlayın. 4. Desorption Metabolomik analiz için 80:20 asetonitile:su (v/v) ve lipidomik analiz için 1:1 izopropanol:metanol (v/v) oluşan desorpsiyon çözeltilerini hazırlayın. 2,0 mL etiketli şişelere yerleştirilen çözeltinin 100°L’lik pipet’i ve daha önce kapağıdelinmiş bir probu her şişeye yerleştirin. Girdap ajitatör üzerinde şişeleri koyun ve 120 dakika için 1.200 rpm ajitasyon hızı ayarlayın. Şişelerden sondaları çıkarın. Elde edilen özler artık enstrümantal analiz için hazırdır. 5. LC-MS analizi LC-MS sisteminin otoörnekleyicisinde ekstreler içeren şişeleri yerleştirin.NOT: Bu çalışmada yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve orbitrap kütle analizörü ile birleşen sıvı kromatografisi (RP, HILIC) kullanılmıştır. Metabolomik analiz parametreleri için adım 5.2’ye gidin. Lipidomik analiz parametreleri için adım 5.6’ya gidin. Ters faz ayırma için pentaflorofenil (PFP) kolonu (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) kullanın. Akış hızını sırasıyla 300 μL/dk’ya, otomatik numune ve kolon sıcaklıklarını ise 4 °C ve 25 °C’ye ayarlayın. Mobil fazları aşağıdaki oranlar doğrultusunda hazırlayın: mobil faz A: su:formik asit (99.9:0.1, v/v) ve mobil faz B: asetonitile:formik asit (99.9:0.1, v/v). Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: mobil faz akışının başlatılması (0-3 dk): 0 A’ya doğrusal bir degrade ve ardından A (3-25 dk) kadar doğrusal bir degrade, A izokratik akışla 34 dakikaya kadar, ardından 6 dakika sütun tekrar denge süresi. HILIC ayırma için hilic kolonu (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A) kullanın. Akış hızını 400 μL/dk olarak ayarlayın. Mobil fazları aşağıdaki oranlar doğrultusunda hazırlayın: mobil faz A: asetonitile:amonyum asetat tampon (9:1, v/v, etkili tuz konsantrasyonu 20 mM), mobil faz B: asetonitrile:amonyum asetat tamponu (1:1, v/v, etkili tuz konsantrasyonu 20 mM). Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: mobil faz akışını (0-3 dk) 0 A’da başlatmak, 3,0 dk tutun ve 5 dk içinde 0 B’ye rampa. 12 dakika kadar% 100 B ile tutun, sütun yeniden denge süresi 8 dakika takip. Tbmktürün aralığını 85-1000 m/z olarak ayarlayın. Pozitif iyonizasyon modunda HESI iyon kaynağı parametrelerini ayarlayın: püskürtme gerilimi 1.500 V, kılcal sıcaklık 300 °C, kılıf gazı 40 a.u., aux gaz akış hızı 15 a.u., probu ısıtıcı sıcaklığı 300 °C, S-Lens RF seviyesi . Cihaz performansını izlemek için analiz edilen her numuneden (düzenli olarak her 10-12 örnek) oluşan QC numunelerini çalıştırın. Ters faz ayırma için C18 kolonu (2,1 mm x 75 mm, 3,5 m) kullanın. Akış hızını sırasıyla 200 μL/dk’ya, otomatik numune ve kolon sıcaklıklarını ise 4 °C ve 55 °C’ye ayarlayın. Mobil fazları aşağıdaki oranlar doğrultusunda hazırlayın: mobil faz A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM amonyum asetat ve 1 mM asetik asit; mobil faz B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM amonyum asetat ve 1 mM asetik asit. Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: 0-1 dk ( B), 1-1,5 dk (-50 B), 1,5-7,5 dk (-70 B), 7,5– 13 dk (70-95% B), 13-17 dk ( B), 17-17.1 dk (95-20% B), 17.1-23 dk (). HILIC ayırma için hilic kolonu (100 x 2,1 mm, 3 μm) kullanın. Akış hızını sırasıyla 400 μL/dk’ya, otomatik numune ve kolon sıcaklıklarını ise 4 °C ve 40 °C’ye ayarlayın. Mobil aşamaları aşağıdaki oranlar doğrultusunda hazırlayın: mobil faz A: ACN; mobil faz B: Suda 5 mM amonyum asetat. Mobil faz akışını aşağıdaki parametrelere göre ayarlayın: 0-2 dk ( B), 2-15 dk (-80 B), 15-15,1 dk (80-96% B), 15,1-21 dk ( B). Pozitif iyonizasyon modunda HESI iyon kaynağı parametrelerini pozitif iyonizasyon modunda ayarlayın gerilim 3.500 V, kılcal sıcaklık 275 °C, kılıf gazı 20 a.u., aux gaz akış hızı 10 a.u., prob ısıtıcı sıcaklığı 300 °C, S-Lens RF seviyesi . Cihaz performansını izlemek için analiz edilen her numuneden (her 10-12 örnekte bir) 10 μL’lik QC numuneleri çalıştırın. Cihazla uyumlu yazılımlarda veri toplama gerçekleştirin. 6. Veri analizi Hedeflenmemiş metabolomik ve lipidomik analizlere adanmış yazılımkullanımı ile veri işleme, putatif tanımlama ve istatistiksel analiz yapın.NOT: Veri yapısını görselleştirmek için temel bileşenler analizi (PCA) ve kutu bıyık çizimleri elde edilebilir.

Representative Results

Numune toplama, yukarıda açıklanan SPME yöntemine göre, 7 mm karışık mod çıkarma aşaması ile kaplanmış problar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örnekleme doğrudan greft dokusundan (transplantasyon öncesi in vivo), böbrek odasında 1 saat, 3 saat, 5 saat ve 7 saat perfüzyon sonrası ekstremite ve alıcıda revaskülarizasyon sonrası in vivo yapıldı. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi (RP, HILIC) kullanımı ile hedeflenmemiş metabolomik ve lipidomik analizler gerçekleştirildi ve kütle analizörü pozitif iyonizasyon modunda ayarlandı. Veri kalitesini değerlendirmek ve sonuçlarla ilgili genel öngörülere ulaşmak için veriler temel bileşen analizine (PCA) tabi tutulmuştu. Şekil 1’degösterildiği gibi, QC örnekleri sıkı bir küme oluşturarak analizlerin kalitesini doğrular. İncelenen gruplar, transplantasyon öncesi ve sonrası metabolik ve lipidomik profillerde ve organ perfüzyonu sırasında ki farklılıkların görüntülenmesiiçin nispeten iyi bir ayrım sergilerler(Şekil 2). SPME örneklemesi zaman içinde organın metabolik profilinin alınmasına izin verir. Seçilen metabolitlerin kutu bıyık çizimleri deney boyunca metabolit düzeylerindeki değişikliklere örnek teşkil eder(Şekil 3). Rp ve HILIC sütunlarında ayrılmış çıkarılan özelliklerin geniş spektrumu Şekil 4’tegösterilmiştir. Şekil 1: Metabolomik ters faz (A), HILIC (B) ve lipidomik ters faz (C), HILIC (D) analizleri için kalite kontrol örneklerinin kümelemesini gösteren temel bileşen analizi. Araçsal istikrarsızlık tarafından indüklenen olası değişiklikleri izlemek için hedefsiz analizde kalite kontrol gereklidir. Sıkı QC örnekleri kümesi, gözlenen tüm değişikliklerin biyolojik kökenli olmasını sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Belirli örnekleme noktaları arasındaki metabolomik (A) ve lipidomik (B) farklarını gösteren temel bileşen analizi. SPME-LC-HRMS ile böbreğin hedeflenmemiş profillemesi, organların korunmasının sonraki adımlarında organlardaki biyokimyasal farklılıkları gözlemlemesini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Peritransplant döneminde metabolitlerde (A, B) ve lipidlerde (C, D) değişiklikler gösteren seçilmiş bileşiklerin kutu bıyık çizimleri. Ayrımcı bileşiklerin seçilmesi ve tanımlanmasından sonra kutu bıyık plotları protokolün sonraki adımlarında bu bileşiklerin düzeylerindeki değişiklikleri izlemek ve farklı koruma protokollerine tabi organlardaki metabolit düzeylerini karşılaştırmak sağlar veya kalp atışı donörleri veya donörler kalp ölümü sonrası farklı donörlerden hasat edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: (A) ters faz ve (B) HILIC ayırma ile LC-MS analizi ile elde edilen özelliklerin iyon haritası (m/z karşı bekletme süresi). Çizim, önerilen protokolle elde edilen toplam özellik sayısını (çıkarmadan algılamaya) tahmin etmeyi ve polarite dayalı analiz kapsamını değerlendirmeyi sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Organ kalitesinin değerlendirilmesi, belirli bir organın organ nakli için uygun olup olmadığı veya atılması gerekip gerekmediği konusunda hızlı bilgi lendirilmiş kararlar alması gereken hekimler için büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Donör yaşı, iskemi süresi, enfeksiyonlar ve inflamatuar süreçler gibi birden fazla faktör uzun süreli greft sonucunu etkileyebilir. Böbrek allogreft fonksiyonunu teşhis etmek için bugüne kadar çeşitli yöntemler geliştirilmiş olsa da, histopatolojik muayene bu konuda altın standart olmaya devam etmektedir3,4,12. Biyopsi prosedürü önceden var olan donör hastalığı ve damar değişiklikleri ile ilgili önemli bilgiler verebilse de, kusurları ücretsiz değildir. Gözlemciler arası değişkenlik ile ilişkili örnekleme hataları ve organ fonksiyonu ile ilgili kapsamlı bilgi için yetersiz glomerülin örneklemesi bu konuda tipik kaygılar olmaya devam etmektedir. Ayrıca, numune hazırlama dondurulmuş kesitler durumunda greft eksik bir değerlendirme gibi bazı konular getiriyor, ve parafin kesit için işlem süresinin uzatılması. Ancak, mikroskobik veya brüt hematüri olarak akut görünebilir kanama riski, biyopsi prosedürü ile ilişkili en önemli hayatı tehdit eden komplikasyondur. Bu nedenle, izin verilebilen biyopsi sayısı kesinlikle transplantasyon prosedürleri sınırlıdır, bu yöntem ile dinamik değişiklikler ve zaman serisi analizleri yakalama engelleyen bir faktör12,13,14. Histolojik analizin yararları metodolojiile ilişkili risklere karşı tartılmalıdır. Histolojik bulguların değeri tartışılmazdır, ancak sapmaların moleküler mekanizmalarını açıklamaz.

Metabolomik ve lipidomik “-omics” bilimsel ailenin en genç etki alanlarıdır. Metabolik ağ içinde birbirine bağlı düşük moleküler (<1.200 Da) insan metabolitleri ve lipitlerinin tamamı insan metabolomu olarak tanımlanır. Genom ömrü boyunca nispeten sabit kalır, mutasyonların neden olduğu hafif değişiklikler seyrek olarak meydana gelir. Metabolom, tüm biyolojik süreçlerdeki değişikliklere ve çevresel faktörlere karşı son derece hassas olan gen ekspresyonunun bir ürünüdür. Metabolitlerin ve lipidlerin dinamik doğası onları mevcut organ durumu7,8,,15,16mükemmel göstergeler yapar. Yukarıda belirtilen protokolde önerilen SPME yöntemi, organın korunması sırasında organın vücuttan alınmasından alıcının vücudundan revaskülarleşmeye kadar olan değişikliklerin tespit edilmesini sağlar. Probun küçük çapı (~200 μm) minimal invazivlik sağlar ve dokuya herhangi bir zarar vermeden aynı organdan çeşitli numuneler sağlar. En sık nakledilen organ olan böbrek kullanılarak yapılan çalışmalar, greftlerin kalitesini ve işlevini düşürmekten sorumlu metabolik yolların daha iyi anlaşılmasını ve daha fazla karakterizasyonuna olanak sağlar. Zaman içinde modifikasyonların izlenme olasılığı, biyopsi gibi konvansiyonel invaziv yöntemlere kıyasla tekniğin önemli bir avantajıdır. Şu anda sunulan analiz, özellikle esansiyel amino asitler, pürinler, pürin nükleozitler ve glikofosfolipidler olmak üzere çeşitli lipid ve metabolit gruplarının değiştirilmiş konsantrasyonlarını saptamaktadır. Bu sonuçlar önceki doku analiz raporları ile tutarlı5,6,17,18,19,20. Bugüne kadar, transplantasyon veya iskemi / reperfüzyon yaralanması (IRI) fenomenleri sonrası komplikasyonlarin indükleyen süreçleri açıklamak için metabolomik veya lipidomik kullanan bilimsel raporların çoğunluğu biyoakış2121,22,23analizi ile sınırlı olmuştur.

Her klinik uygulama, analitik yöntemin performansının beklenen kriterleri karşılamasını sağlamak için örnekleme protokolünün optimizasyonunu gerektirir. Bu bağlamda, SPME’den yararlanmanın yararı, çeşitli deneysel tasarımlar için koşulları ayarlama imkanıdır. Erişilebilir ekstraksiyon aşamalarının çeşitliliği, çeşitli polaritelere sahip ekstrakte edilmiş metabolitlerin geniş bir spektrumunu sağlar. Aynı zamanda, her sorbent belirli özelliklere doğru seçicilik sağlar ve örnek matris mevcut tüm bileşikleri ayıklamak değil gerçeği nedeniyle bu yöntemin bir sınırlama olarak kabul edilebilir. Bu SPME kaplamalar sadece serbest moleküller üzerinden ayıklamak unutulmamalıdır, ve sadece analit bağlı bir kısmı ile etkileşime girmez. Kaplamaların biyouyumluluğu dokuya toksisite getirmezken proteinler gibi büyük moleküllerin çıkarılmasını kısıtlamaz; sonuç olarak, enzimatik süreçler numune toplama aşamasında zaten inhibe edilir ve eserlerin varlığı en aza indirgenmiş, bu da alternatif örnekleme yöntemlerine göre büyük bir avantajdır. Kaplamanın uzunluğu ekstraksiyon verimliliğini etkiler (yani, kaplamanın uzunluğu yüzey alanını ve ekstraksiyon faz hacmini belirler); böylece, daha uzun kaplamalar daha yüksek geri kazanımlar verir. Diğer taraftan, daha kısa kaplamalar daha yüksek uzamsal çözünürlük sağlar. Güvenilir sonuçlar için, sondayı böbrek korteksinin aynı derinliğine batırmak çok önemlidir. Çok derin yerleştirme böbrek medulla girme riskine neden olur. Çıkarma süresi de çıkarma verimliliği ile orantılıdır. Bu nedenle, optimum çıkarma süresi seçimi SPME yöntemi geliştirmenin en kritik adımlarından biridir. Zaman ölçümünün doğruluğu en yüksek tekrarlanabilirliği sağlar. Tartışılan gibi biyolojik uygulamalarda, analitik protokolün duyarlılığı ve tekrarlanabilirliği ile tıbbi prosedürün kısıtlamaları arasında her zaman bir uzlaşma vardır. Denge ekstraksiyonu en yüksek hassasiyeti sağlarken, güvenlik nedenlerinden dolayı, ekstraksiyon süresi ameliyatın toplam süresini etkilememesi gerektiğinden, bu tür uygulamalarda ön denge koşulları genellikle kullanılır. Desorpsiyon verimliliği proses in zaman ve kromatografikayırma9 ,10,,11için kullanılan mobil faz ile uyumlu olmalıdır desorpsiyon çözücü, bileşimi tarafından belirlenir.

Cerrahi içi değerlendirmelerde kullanılan tanısal aletin en önemli gereksinimlerinden biri analiz zamanıdır. Mevcut girişimleri in vivo SPME ekstraksiyon mikroakışkan açık arayüzü (MOI)24 veya kaplamalı bıçak spreyi (CBS)25ile bir kütle spektrometre doğrudan birleştiğinde için hızlı bir araç geliştirmek için yapılmaktadır. Bu tür yaklaşımlar, analitik sonuçların gerçek zamanlı veya gerçek zamanlıya yakın bir şekilde açıklanmasına olanak sağlayacaktır. Metabolik ve lipidomik profillerin müdahale öncesi analizleri için bu yöntemlerin kullanılması, organ nakli işlemleri sırasında karar verme sürecini geliştirerek organ yetmezliği durumunda mümkün olan en iyi kişiselleştirilmiş yaklaşımı ve hızlı yanıtı sağlayabilir.

Özetle, önerilen protokolün böbrek greftlerinin tam metabolik ve lipidomik profillerine ulaşmasını sağlayacağı ve bunun da organ kalitesinin kapsamlı bir değerlendirmesini ve iskemi-reperfüzyon yaralanmasından sorumlu süreçlerin karakterizasyonunu sağlayacağı varsayımında dır. Projenin yenilik katı faz mikroekstraksiyon (SPME), metabolomik ve lipidomics analizi (örneğin, Orbitrap yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi) için mevcut en yenilikçi teknolojilerden biri ile birlikte, yaşam sistemlerinin düşük invaziv örnekleme sunan kullanımını içerir. SPME, metabolitlerin numune toplama, ayıklama ve söndürmesini tek bir adımda birleştirerek hızlı analiz için mükemmel bir araç haline getirir. Bu protokolün, böbreklerin organ nakli öncesi koşullarının hangi lerinin organ fonksiyonlarının gecikmeli olması veya organ nakli sonrası işlev bozukluklarından sorumlu olduğu ve greft koruma protokolünün organın biyokimyasını nasıl etkilediği ile ilgili soruların yanıtlanılmasına yardımcı olması beklenmektedir. Bu tür bilgiler sadece transplantasyona bağlı olası komplikasyonların önlenmesinde önemli bir etkiye sahip olmakla kalmamış, aynı zamanda mevcut greft koruma protokollerinin iyileştirilmesine, canlı organ nakli dokusunun ve can kaybının en aza indirilmesine yardımcı olabilir. Önerilen çözüm, belirli potansiyel biyobelirteçlerin doğrulanması ve transplantolojide terapötik sonuçların iyileştirilmesi de dahil olmak üzere bu alanda daha fazla araştırmanın önünü açacaktır.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma, Ulusal Bilim Merkezi’nden Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar MilliporeSigma, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya SPME cihazları sağlamak için bir iş kabul etmek istiyorum. Merck’in yaşam bilimi işi ABD ve Kanada’da MilliporeSigma olarak faaliyet göstermektedir. Ayrıca, yazarlar Q-Exactive Focus orbitrap kütle spektrometresi erişim için Thermo Fisher Bilimsel teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Dr Aleksandra Woderska-Jasińska ve Transplantoloji ve Bydgoszcz Genel Cerrahi Bölümü personeli projede kendi tür yardım için teşekkür etmek istiyorum. BB, Waterloo Üniversitesi’nde kaldığı süre boyunca Toronto General Hospital’da numune toplama fırsatı verdiği için Prof. Janusz Pawliszyn’e teşekkür etmek istiyor.

Materials

Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. . Organ Procurement and Transplantation Network Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019)
  2. Branger, P., Undine, S. . Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , (2018).
  3. Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
  4. Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
  5. Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  6. Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
  7. Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
  8. Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
  9. Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
  10. Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research – How far are we from daily practice. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
  11. Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
  12. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
  13. Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
  14. Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
  15. Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
  16. Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
  17. Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
  18. Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
  19. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
  20. Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
  21. Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
  22. Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
  23. Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
  24. Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
  25. Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).

Tags

Chemical BiopsyOrgan TransplantationGraft Quality AssessmentSPME ProbesBiocompatible CoatingsTumor AnalysisPreconditioning MixtureSterilizationKidney CortexMetabolomic AnalysisLipidomic AnalysisLiquid ChromatographyMass Spectrometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image