Использование химической биопсии для оценки качества трансплантата

Оценка качества органов остается большой проблемой для врачей, которые должны принимать быстро обоснованные решения относительно того, является ли данный орган жизнеспособным для трансплантации или же он должен быть отброшен. Несколько факторов, таких как возраст донора, продолжительность ишемии, инфекции и воспалительные процессы, могут повлиять на долгосрочный исход трансплантата. Хотя различные методы были разработаны на сегодняшний день для диагностики функции алотрансплантата почек, гистопатологический осмотр остается золотым^{стандартом в этом вопросе 3,4,12}. Хотя процедура биопсии может дать значительную информацию о уже существующих донорских заболеваний и сосудистых изменений, она не свободна от недостатков. Типичными проблемами в этой связи остаются ошибки выборки, связанные с вариативностью интеробсерверов и выборкой недостаточного гломерули для получения всеобъемлющей информации о функции органов. Кроме того, подготовка образцов приводит к некоторым вопросам, таким, как неполная оценка трансплантата в случае замерзших секций и продление срока процедуры секции парафина. Тем не менее, повышенный риск кровоизлияния, которое может показаться остро, как микроскопические или валовой гематурии, является основным опасным для жизни осложнение, связанное с процедурой биопсии. По этой причине количество допустимых биопсий строго ограничено в процедурах трансплантации, фактор, который препятствует захвату динамических изменений и анализов тайм-рядов^{с помощью этого метода 12,,13,,14}. Преимущества гистологического анализа должны быть взвешены с рисками, связанными с методологией. Ценность гистологических находок неоспорима, но они не объясняют молекулярные механизмы аберраций.

Метаболомика и липидомика являются самыми молодыми областями научного рода «омиков». Полный набор низкокалорийных метаболитов и липидов, соединенных в метаболоме человека, определяется как метаболома человека. Геном остается относительно постоянным на протяжении всей своей жизни, с небольшими изменениями, вызванными мутациями, происходящими нечасто. Метаболом является продуктом экспрессии генов, который очень чувствителен к изменениям во всех биологических процессах, а также к факторам окружающей среды. Динамический характер метаболитов и липидов делает их идеальными показателями текущего состояния органов^{7,,8,,15,,16.} Метод SPME, предложенный в вышеупомянутом протоколе, позволяет выявлять изменения, происходящие в органе во время его сохранения, начиная от удаления органов из организма донора и до реваскуляризации у реципиента. Малый диаметр зонда обеспечивает минимальную инвазивность и позволяет проводить несколько проб из одного и того же органа, не нанося никакого ущерба ткани. Проведение исследований с использованием почек, как наиболее часто пересаженного органа, позволяет лучше понять и дальнейшую характеристику метаболических путей, ответственных за снижение качества и функции трансплантатов. Возможность мониторинга изменений с течением времени, безусловно, является важным преимуществом техники по сравнению с обычными инвазивными методами, такими как биопсия. Представленный в настоящее время анализ выявил измененные концентрации различных групп липидов и метаболитов, особенно незаменимых аминокислот, пуринов, нуклеозидов пурина и глицерофосфолипидов. Эти результаты согласуются с предыдущими отчетами^{анализа тканей 5,,6,,17,,18,,19,,20.} На сегодняшний день большинство научных докладов с использованием метаболомики или липидомики для объяснения процессов, вызывающих осложнения после трансплантации или ишемии / реперфузии травмы (ИРИ) явления были ограничены анализом биофлюидов^21,22,23.

Каждое клиническое применение требует оптимизации протокола отбора проб для обеспечения того, чтобы производительность аналитического метода соответствовала ожидаемым критериям. В этой связи преимуществом использования SPME является возможность корректировки условий для различных экспериментальных проектов. Разнообразие доступных фаз экстракции обеспечивает широкий спектр извлеченных метаболитов с диверсифицированной полярности. В то же время это может рассматриваться как ограничение метода в связи с тем, что каждый сорбент обеспечивает избирательность по отношению к конкретным особенностям и не извлекает все соединения, присутствующие в матрице образца. Следует отметить, что покрытия SPME извлекаются только через свободные молекулы, и просто не взаимодействуют с связанной долей аналита. Биосовместимость покрытий не вводит токсичность в ткань, сдерживая при этом экстракции крупных молекул, таких как белки; как следствие, энзиматические процессы тормозятся уже на этапе сбора проб, и наличие артефактов сводится к минимуму, что является большим преимуществом по сравнению с альтернативными методами отбора проб. Длина покрытия влияет на эффективность извлечения (т.е. длина покрытия обозначает площадь поверхности и объем фазы извлечения); таким образом, более длинные покрытия дают более высокую урожайность. С другой стороны, более короткие покрытия обеспечивают более высокое пространственное разрешение. Для получения надежных результатов крайне важно погрузить зонд на точно такую же глубину коры почек. Вставка слишком глубоко вызывает риск входа в почечную медуллу. Время добычи также пропорционально эффективности добычи. Поэтому выбор оптимального времени извлечения является одним из важнейших шагов в разработке метода SPME. Точность измерения времени обеспечивает наивысшую повторяемость. В биологических приложениях, таких как обсуждаемая, всегда существует компромисс между чувствительностью и повторяемостью аналитического протокола и ограничениями медицинской процедуры. В то время как равновесная экстракция обеспечивает высокую чувствительность, по соображениям безопасности, в таких приложениях часто используются пред равновесные условия, так как время извлечения не должно влиять на общую продолжительность операции. Эффективность desorption определяется временем процесса и составом растворителя desorption, который должен быть совместим с мобильной фазой, используемой для хроматографического разделения^9,,10,11.

Одним из основных требований к диагностическим приборам, используемым для внутрихирургических оценок, является время анализа. Текущие попытки предпринимаются для разработки быстрого инструмента для извлечения in vivo SPME в сочетании непосредственно с масс-спектрометром через микрофлюидный открытый интерфейс (MOI)²⁴ или спрей с покрытием лезвия (CBS)²⁵. Такие подходы позволили бы раскрывать аналитические результаты в реальном или близком к реальном времени времени. Использование таких методов для предварительного вмешательства анализ метаболических и липидомных профилей могло бы улучшить процесс принятия решений во время трансплантации процедур, что позволило бы наилучшим персонализированным подходом и быстрой реакцией в случае отказа органов.

Таким образом, предполагается, что предлагаемый протокол позволит получить полный метаболический и липидомный профили трансплантатов почек, что, в свою очередь, даст всеобъемлющую оценку качества органов и характеристику процессов, ответственных за ишемию-реперфузию. Новизна проекта включает в себя использование твердой фазы микроэкстракции (SPME), предлагая низкоинвазивную выборку живых систем, в сочетании с одной из самых инновационных технологий, доступных для метаболомики и липидомического анализа (например, масс-спектрометр высокого разрешения Orbitrap). SPME сочетает в себе сбор образцов, экстракции и затухание метаболитов в один шаг, что делает его идеальным инструментом для быстрого анализа. Ожидается, что этот протокол поможет ответить на вопросы, связанные с тем, какие предплантуационной состояния почки отвечают за задержку функции органа или его дисфункции после трансплантации, а также как протокол сохранения трансплантата влияет на биохимию органа. Такие знания не только оказывают существенное влияние на профилактику возможных осложнений, связанных с трансплантацией, но и могут способствовать улучшению действующих протоколов сохранения трансплантата, минимизируя потерю жизнеспособной трансплантационной ткани, а также гибель людей. Предлагаемое решение откроет двери для дальнейших исследований в этой области, включая проверку конкретных потенциальных биомаркеров и улучшение терапевтических результатов в трансплантологии.