Isolatie van Cardiomyocyten uit vaste harten voor immunocytochemie en ploidy-analyse

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en goedgekeurd door de Universiteit van Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Voorbereiding van de oplossingen en chirurgische apparatuur Steriliseer voorafgaand aan de isolatie de chirurgische apparatuur met behulp van 70% ethanoloplossing. Voeg 2,24 g KCl toe aan 500 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een uiteindelijke concentratie van 60 mM te verkrijgen. Bewaar KCl-PBS-oplossing op kamertemperatuur. Gebruik 3 mL KCl-PBS-oplossing per muis. Verdun 32% paraformaldehyde (PFA) oplossing met PBS tot het verkrijgen van de uiteindelijke concentratie van 4% PFA. Bereid 10 mL van 4% PFA in PBS per muis. Verdunde PFA-oplossing kan 2-3 weken in een glascontainer worden opgeslagen bij 4 °C.LET OP: Bereide 4% PFA-oplossing kan voor langere tijd bij -20 °C worden opgeslagen. Bereid 1 mL collagenase oplossing per muis door het toevoegen van 60 mg collagenase, type 2 per 1 mL PBS. 2. Perfusie en fixatie van het hart Verdoven het dier door gebruik te maken van 2-5% isoflurane met een zuurstofstroom van 1 L/min. Bevestig de anesthesie door het gebrek aan beweging en een lager ademhalingspercentage te bevestigen.OPMERKING: Het injecteren van heparine (100-500 U/kg) vóór euthanasie kan de celkwaliteit en opbrengst verhogen door bloedstolsels te voorkomen, waardoor een efficiëntere perfusie van het hart met fixatief mogelijk wordt. Euthanasereren het dier volgens goedgekeurde methoden.OPMERKING: We volgden de Richtlijnen van de American Veterinary Medical Association voor de euthanasie van dieren en kregen lokale IACUC-goedkeuring voor euthanasie. Plaats het geëuthanaseerde dier in supine positie, en tape naar beneden verlengde ledematen. Snijd door de borst om het hart bloot te stellen met behulp van stompe schaar. Snijd aflopende aorta en inferieure caval ader. Doorsnede het hart door het injecteren van 3 mL van KCl-PBS oplossing door de linker ventrikel met een stroomsnelheid van 3 mL / min met behulp van een peristaltische pomp bevestigd aan een infusie set met een 23 G vlindernaald (26 G voor neonaten). Zorg ervoor dat u niet door het septum doorboort.OPMERKING: Gebruik ook een naald die aan een spuit is bevestigd om oplossingen te injecteren. Doorsnee het hart door het injecteren van 10 mL van 4% PFA oplossing voor 10 minuten met behulp van een peristaltische pomp met een snelheid van 1 mL/min. Verwijder het hele hart met een schaar. Na het verwijderen van het hart is het mogelijk om een specifieke regio van het hart te isoleren door in te peren. Plaats het hart, of een segment ervan in een 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 mL van 4% PFA oplossing. Broed het hart op rocker op kamertemperatuur met schommelsnelheid tussen 20-30 rpm voor 1 uur. 3. Isolatie van vaste cardiomyocyten Plaats het hart in een petrischaaltje met PBS-oplossing. Knijp het hart om zich te ontdoen van een PFA resterende in ventrikels, en wassen in PBS. Zet het vaste hart in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis met collagenase oplossing (60 mg/mL). Plaats de buis op tuimelschakelaar (20-30 rpm) bij 37 °C voor nachtelijke incubatie.OPMERKING: Verleng de incubatietijd tot 1 week en vul de collagenase-oplossing om de twee dagen aan om de mogelijke variatie in opbrengst te verminderen als er naar verwachting harten fibrotisch zijn, wat mogelijk langer tijd van collagenase spijsvertering nodig heeft om extracellulair collageen te verteren. Doe collagenase oplossing en het hart in een petrischaaltje van 35 mm. Dissociate het hart in stukken van 1 mm met behulp van tangen of scharen. Gebruik een transferpipet om het gescheiden weefsel gedurende 2 minuten verder te tritureren. Als weefseldeeltjes nog steeds in de schotel blijven, gebruik dan een transferpipet met smallere opening en zet trituratie voort. Ga door totdat het grootste deel van het weefsel is afgebroken.OPMERKING: Over trituratie zorgt ervoor dat individuele cardiomyocyten breken. Zorg ervoor dat niet over trituraat door regelmatig te controleren onder een microscoop. Plaats een 200-600 μm nylon gaas over de opening van 15 mL centrifuge buis.OPMERKING: Voor hypertrofie cardiomyocyten wordt aanbevolen om 400 μm nylon mesh te gebruiken in plaats van 200 μm. Voeg 5 mL PBS toe aan de petrischaal met gescheiden cellen en filter de oplossing door nylon gaas, inclusief weefseldeeltjes. Was het nylon gaas door extra 4 mL PBS door te geven. Centrifugeren de gefilterde oplossing op 10-100 x g gedurende 1 min.LET OP: 100 x g centrifugatie zal niet opleveren 100% pure cardiomyocyte bevolking, en sommige niet-cardiomyocyte cellen zijn waarschijnlijk worden opgenomen. Gooi de supernatant, tenzij men wil vlek / evalueren niet-cardiomyocyten hartcellen ook. Resuspend de pellet in 10 mL PBS voorafgaand aan vlekken. 4. Kleuring cardiomyocyten Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min en voeg 5 mL permeabilisatieoplossing toe (bijvoorbeeld 0,5% Triton X-100 in PBS). Incubeer voor 20 min bij kamertemperatuur op rocker.OPMERKING: Voor de stappen 4.1, 4.2 en 4.4 gebruik 15 mL centrifugebuizen omdat het gemakkelijker is om het supernatant te verwijderen zonder de celpellet te storen in vergelijking met 1,5 mL microcentrifugebuizen. Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min, voeg 5 mL blokkeerbuffer toe (bijvoorbeeld 3% runderserumalbumine [BSA] in PBS) en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rocker. Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min en voeg 1 mL primaire antilichaamoplossing (in PBS) toe met de juiste verdunningsverhouding. Breng de oplossing in 1,5 mL microcentrifugebuis en incubeer cardiomyocyten in primaire antilichaamoplossing onder geoptimaliseerde omstandigheden (bijvoorbeeld 4 °C ‘s nachts). Breng cardiomyocyten met primaire antilichaamoplossing over naar een centrifugebuis van 15 mL en voeg 9 mL PBS toe. Incubeer de cardiomyocyten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rocker. Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min en voeg 10 mL PBS toe. Incubeer de cardiomyocyten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rocker. Herhaal deze stap nogmaals. Verzamel de cellen door centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min en voeg de secundaire antilichaamoplossing toe die DAPI bevat. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rocker, gevolgd door twee keer stap 4,5 te herhalen om cardiomyocyten te wassen. Plaats de cellen op coverslips of microscoop-compatibele platen en ga verder met beeldvorming.LET OP: Afbeeldingen in het manuscript zijn gemaakt met 10x en 40x doelstellingen. Gebruikte lasers waren: 405 nm voor DAPI, 561 nm voor Alpha actinine en 640 nm voor Edu. 5. Software voor het instellen van beeldvorming OPMERKING: Volg deze stappen met behulp van Supplementy File 1-SoftwareScreenshots.pdf. Download de Fiji-distributie van ImageJ. Open Fiji. Klik op Help > Bijwerken… > Updatesites beheren. Controleer de updatesites “IJPB-plugins” en “Biomedgroup” om de afhankelijkheden plugins Ellipse Split en Morpholibj te downloaden. Klik op Sluiten. Fiji moet beginnen met het downloaden van de afhankelijkheden. Start Fiji opnieuw op als je klaar bent. Download Rstudio en open het. Kopieer install.packages(c(“ggplot2”, “autothresholdr”, “dplyr”, “purrr”, “jsonlite”, “shiny”)) in de opdrachtregel van de R-console en druk op de Enter-toets. Typ “y” in reactie op alle aanwijzingen om alle R-afhankelijkheden te installeren (Screenshot 1 in aanvullend bestand 1). 6. Beeldkwantificering Open Fiji en sleep “AnalyzeNucleation.py” (geleverd als aanvullende codebestand) naar de statusbalk van Fiji. Hiermee wordt een venster voor het bewerken van scripts geopend. Klik linksonder op Uitvoeren om te beginnen (Screenshot 2 in Aanvullend bestand 1). Er verschijnt een dialoogvenster(Aanvullend bestand 1:Screenshot 3) waarin wordt gevraagd naar de locatie van de uitvoergegevensmap. Alle analysegegevens, cijfers en andere gegevens die door deze software worden gebruikt, worden in deze map opgeslagen. Een ander, groter dialoogvenster verschijnt, met alle instellingen voor beeldanalyse(Aanvullend bestand 1:Screenshot 4). Selecteer de locatie van de map met afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd. Voer de bestandsindeling voor afbeelding in met reguliere expressies. Voer de bestandsindeling voor afbeelding in, die aangeeft welke delen van de bestandsnaam overeenkomen met rij-, kolom-, kanaal- en (optioneel) site binnen braces, met behulp van reguliere expressies. Plaats geen spaties in de beugels. Variabele delen van de bestandsnaamindeling omringen in braces {}. De manier waarop bestanden worden opgeslagen, is afhankelijk van de beeldsoftware en deze stap haalt relevante informatie op uit de afbeeldingsbestandsnaam.OPMERKING: de tekenreeks voor opmaakr” Plaat 1-(? P[A-Za-z]+)(? P[0-9]+)-(? P[A-Za-z]+).tif”beschrijft een bestandsnaam die begint met “Plaat 1-“, die wordt gevolgd door een of meer alfabetische letters die de rij aangeven, gevolgd door een of meer cijfers die de kolom aangeven, die wordt gevolgd door “-“, die wordt gevolgd door een of meer letters die het kanaal aangeven, gevolgd door “.tif”. De letters in de hoekhaakjes zoals “” zijn variabele namen en worden automatisch gekopieerd naar de gegevens wanneer deze worden verzameld. Een van de variabele namen moet “” zijn Geef de naam aan van kanalen waarin de nucleaire vlek zichtbaar is en waar de cardiomyocyten zichtbaar zijn. Deze namen moeten precies zijn zoals ze zijn in het deel dat wordt geëersed door de variabele “” in de bestandsnamen voor reguliere expressie. Geef aan hoe de afbeeldingen moeten worden gegroepeerd met variabele namen die van komma’s zijn gescheiden. Alle afbeeldingen binnen een bepaalde groep worden in één batch geopend en geanalyseerd. Als de afbeeldingen bijvoorbeeld zijn onderverdeeld in sets voor elke put en er een goed is voor elke unieke combinatie van rij en kolom, schrijf dan ‘rij, kolom’ in dit veld.OPMERKING: Deze groeperingsvariabelen moeten een subset zijn van de variabelen die in de opmaaktekenreeks worden gebruikt. Gebruik ‘kanaal’ niet als groeperingsvariabele, dit scheidt overeenkomstige kanaalafbeeldingen van elkaar. Geef aan of afbeeldingen al dan niet in één putafbeelding aan elkaar zijn genaaid of voor elke site gescheiden zijn. In het eerste geval mag de site niet worden aangegeven in de tekenreeks bestandsnaam. Kies welke drempelmethode moet worden gebruikt om kernen van de achtergrond te scheiden. Alle standaard thresholdingsmethoden van Fiji zijn beschikbaar. Test verschillende drempelmethoden om te bepalen welke het beste werkt voor de afbeeldingsset. Kies in dit voorbeeld de Otsu-methode. Geef aan of de drempelwaarde voor elke siteafbeelding opnieuw moet worden berekend of dat voor elke afbeelding in de groep dezelfde drempelwaarde moet worden gebruikt. Geef aan of de cardiomyocyte-beelden brightfield zijn of een fluorescerende markering gebruiken. Geef de cardiomyocyte thresholding methode aan. Als brightfield in de vorige stap is gekozen, wordt deze drempelmethode toegepast op helderdere veldafbeeldingen met een rand. Geef aan of de drempelwaarde voor elke siteafbeelding opnieuw moet worden berekend of dat voor elke afbeelding in de groep dezelfde drempelwaarde moet worden gebruikt. Geef het aantal rijen siteafbeeldingen aan dat elk goed beslaat. Geef het aantal kolommen met siteafbeeldingen aan dat elk goed bestrijkt. Geef het minimumoppervlak van kernen in pixels aan. Gebruik een royaal lage minimumgrootte, een hogere en nauwkeurigere drempel wordt berekend in de analysestap. Geef het minimumgebied van cardiomyocyten aan. Klik na het kiezen van de gewenste instellingen op OK. Afbeeldingen die lijken op afbeeldingen in figuur 3 en figuur 4, verschijnen op het scherm, met de verschillende stadia van de analysepijplijn. Inspecteer deze afbeeldingen om ervoor te zorgen dat drempelwaardering en segmentatie correct plaatsvinden. De geselecteerde resultatenmap moet nu worden gevuld met analysegegevens(Aanvullend bestand 1: Screenshot 5). Andere bestanden dan analysegegevens kunnen veilig worden opgeslagen in deze map, zolang hun namen niet beginnen met “cm_”, “nuclei_” of “nucleilink_”. 7. Gegevensanalyse OPMERKING: De geproduceerde csv-bestanden kunnen handmatig worden geanalyseerd. Elke geanalyseerde afbeeldingssubset produceert een triplet csv-bestanden met de naam “nuclei(metadata).csv”, “nucleilink(metadata).csv” en “cardiomyocyten(metadata),csv”, waarbij (metadata) wordt vervangen door een reeks naam-waardeparen van het formulier “_(name)=(waarde)”, waarbij (naam) en (waarde) sequenties van alfanumerieke tekens zijn die zijn afgeleid van tekenreeksen die overeenkomen met de reguliere expressie die eerder is gegeven. (Als bijvoorbeeld rij en kolom in de bestandsnamen zijn aangegeven, zijn tekenreeksen als ‘_row=F’ en ‘_column=8’ aanwezig). De naamloze linkerste kolom van elke kernen en kernenlink bestand is een kern-ID-nummer. De “Min” kolom van de kernenlink bestand is de id van de cardiomyocyte die bevatte zei kern geheel of 0 anders. De “Max” kolom van de kernen is de ID van de hoogst genummerde cardiomyocyte die deze kern voor een deel bevatte, of 0 anderszins. De “Gemiddelde” kolom van het cardiomyocyten-bestand is het cardiomyocyte id-nummer. Open “AnalyzeMultinucleatedServer.R” in Rstudio (verstrekt als aanvullend codebestand). Boven aan dit bestand bevindt zich een variabele met de naam “folderName”. Ernaast is een filepath. Typ hier het pad naar de uitvoergegevensmap die in de laatste stap is geselecteerd, zonder de laatste slash(Aanvullende bestand 1: Schermafbeelding 6). In de linkerbovenhoek van het venster voor het bewerken van scripts moet er een groene pijl met het label Run Appstaan. Klik op deze pijl. Het kan enige tijd duren voordat de gegevens zijn geladen en dat de app is op te duiken. In eerste instantie zullen drie gatinggrafieken zichtbaar zijn, één om de minimale geldige kernareaaldrempel aan te geven, één om de minimale geldige kernintensiteitsdrempel aan te geven, en één om de maximale geldige minimumbemestingsdiameter voor cardiomyocyten aan te geven. Gebruik de schuifregelaars om deze drempelwaarden in te stellen(Aanvullend bestand 1: Screenshot 7).OPMERKING: In elk van deze grafieken moet een grote, brede piek aanwezig zijn die overeenkomt met geldige kernen of cardiomyocyten, geflankeerd door brede staarten die puin of foutieve gesegmenteerde cardiomyocyten vertegenwoordigen. Gebruik de drempels om een staart van elk van de pieken af te snijden. Scroll naar beneden. Klik op de knop Geselecteerde drempelwaarden toepassen (onder aan Aanvullend bestand 1: Screenshot 7). Klik op de knop Plotintensiteitsverdeling. Hierdoor wordt voor elke groepingsvariabele een plot van de verdeling van de nucleaire intensiteit van zowel de gehele steekproef als afzonderlijke subplots weergegeven.OPMERKING: Als bijvoorbeeld en groeperingsvariabelen zijn ingevoerd in de reguliere expressie in het dialoogvenster Fiji, worden hier plots weergegeven die de intensiteitsverdeling per rij en per kolom aangeven(Aanvullend bestand 1: Schermafbeelding 8). Als de verlichting en de kleuringsvoorwaarden constant waren over de verschillende delen van het monster, zouden deze percelen allen duidelijk twee intensiteitspieken moeten tonen, dimmer, langere voor de diploïde kernen en helderder, kortere voor de tetraploid kernen. Intrasample variatie zal resulteren in dit patroon niet zichtbaar in de hele steekproef plot en er is grote variatie in de locatie van de diploïde en tetraploïde pieken per rij, kolom, of andere groepering variabele. In het laatste geval schuift u naar beneden het selectievakje Afzonderlijk normaliseren per groep aan om rekening te houden met deze variatie(Aanvullend bestand 1: Screenshot 9). Klik op de knop Ploidy berekenen (Aanvullend bestand 1: Screenshot 9). Klik op de knop Plot Estimated Ploidy Distribution. Grafieken worden weergegeven in de lege vensters aan de rechterkant. In de genormaliseerde hele-sample grafiek, moet de twee-piek patroon zichtbaar zijn als het niet eerder was. Selecteer drempels om de diploïde en tetraploïde pieken van elkaar en uitschieters te isoleren met behulp van de schuifregelaars(Aanvullend bestand 1: Screenshot 9). Scroll naar beneden. Klik op de knop Ploidy en Nucleation (Aanvullend bestand 1: Screenshot 10). Klik op de map Plot en Opslaan in resultaten. De plot opgeslagen in de geselecteerde resultaten map zal ook verschijnen in dit interactieve venster(Aanvullende bestand 1: Screenshot 10).