세포 내 빠른 광화학적 단백질 산화로 세포 단백질 특성화

1. IC-FPOP 유동 시스템 설정 유량 계통의 조립을 시작하려면 분열 석을 사용하여 융합 된 실리카를 크기로 잘라냅니다. IC-FPOP 유동 시스템은 4개의 12cm 및 17cm 의 융합 실리카를 450μm의 내경(ID)과 670μm의 외경(OD) 1개, 24cm 24cm 및 40cm 의 ID로 75μm, 360 μm의 OD를 필요로 합니다. , 마지막으로 150 μm의 ID와 360 μm의 OD와 두 57cm.참고 : 실리카 튜브를 절단 할 때, 부드럽게 폴리 이미드 코팅을 긁어, 가장 깨끗한 컷을 얻기 위해 구부려. 직선 컷인지 확인하십시오 (막힘이나 누출 폼을 보장하기 위해 필요합니다). 나노 타이트 슬리브(0.0155″ ID X 1/16″ OD 360μm OD 실리카 튜브및 0.027″ ID X 1/16″ OD 670 μm OD 실리카 튜브를 사용하여 15개의 연결을 설정) 슈퍼 플란젤 너트 PEEK 1/4-28 플랫-바텀 1/16″ 및 수퍼 플랑스트 스트랑 Tefzel (ETFE), 1/4-28 플랫 바닥, 1/16″ OD. 제조업체의 프로토콜에 따라 연결을구성합니다(그림 1). 작은 원통형 자석 6개를 500 μL 주사기 하나에 놓습니다. 이 주사기를 다른 500 μL 주사기와 2개의 5mL 주사기와 함께 채우고 공기를 제거합니다. 그림 2A에표시된 대로 주사기 펌프의 위치.참고: 5mL 주사기는 500 μL 주사기보다 크므로 모든 주사기를 동시에 조이기 위해 스페이서가필요합니다(그림 2B). 주사기 펌프 스토퍼를 조이면 모터가 정지할 때 셀 주사기가 약 50 μL 남았습니다. 이렇게 하면 마그네틱 스터러를 위한 공간이 남습니다. (그림2C-D).주의: 주사기 펌프가 자석에 압력을 가하면 주사기가 막히고 주사기가 파손될 수 있습니다. Luer 어댑터를 사용하여 수동 밸브를 각 주사기에 연결합니다. 그림 3과같이 실리카 튜브를 조립합니다.참고 : 셀 + H2O2로 선을 다른 쪽으로 십자가를 통과합니다. 그런 다음 450 μm ID 실리카 튜브에 삽입합니다. 5 mL 주사기의 칼집 버퍼는 세포 및H2O2보다더 빠른 속도로 흐를 것이다. 양쪽에 칼집 버퍼를 사용하면 세포가 방사선 조사를 위해 한 줄로 유체 역학적으로 집중됩니다. 레이저 옆에 위치 흐름 시스템. 라이터를 사용하여 450 μm ID 튜브의 실리카 코팅을 태워 레이저 조사를 위한 창을 만듭니다. 6개의 자석을 포함하는 셀 주사기 위에 자기 교반기 위에 놓습니다. 주사기 펌프를 492.4 μL/min으로 설정하여 1,083.3 μL/min. 시스템을 통해 유량 버퍼를 세 번 세척하고 누출을 테스트합니다. 볼록 렌즈를 사용하여 엑시머 레이저를 실리카 튜브에 초점을 맞춥니다. 일단 집중, 실리카 튜브 뒤에 종이의 작은 조각을 배치 하 여 조사 창을 테스트 하 고 레이저를 켭니다. 방사선 조사에서 연소된 영역을 측정합니다. 조사 창 과 유량을 사용하여 필요한 레이저 주파수를 계산하여 0의 배제 분율을 얻습니다.참고: IC-FPOP 실험에 권장되는 레이저 에너지는 ≥120 mJ입니다. 조사 창이 2.58mm이고 유량이 1083.3μL/min인 제외 분율을 얻으려면 주파수가 44이어야 합니다. 다음은 조사 창, 유량 및 배제 분율이 알려진 경우 레이저 주파수를 계산하는 데 필요한 방정식입니다.여기서 w는 nL의 부피이고, x는 mm의 레이저 스폿 폭이고, y는 μm의 실리카 튜브 ID이고, v는 μL의 총 부피이고, b는 배제 분율이고, a는 μL/min의 유량이고, f는 Hz의 주파수이다. 2. 담금질 과 H2O2 확인 100 mM N-tert-부틸- 알파-페닐니트론 (PBN) 및 100 mM N, N’-디메틸티우레아 (DMTU)를 포함하는 담금질을 확인하십시오. Aliquot 11 mL의 담금질 각 샘플은 50 mL 원추형 튜브로. 희석 H2O2 ~ 200 mM. 각 샘플은 H2 O2의500 μL을 요구합니다.2참고 : 담금질은 전날 만들 수 있으며 빛으로부터 보호된 밤새 4 °C에서 보관할 수 있습니다. H2O2는 실험당일에 신선하게 만들어야 한다. 3. 세포 수집 T175 플라스크에서 세포를 약 70-90% 컨플루엔성으로 성장시다. 미디어를 제거하고 버퍼로 헹입니다.참고: 사용할 일반적인 버퍼는 세포 배양 등급 덜베코의 인산 완충 식염수(DPBS) 또는 행크의 균형 잡힌 염분 용액(HBSS)입니다. 트립신-EDTA 또는 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리합니다. 일단 버퍼의 10 mL에서 다시 중단하고 세포를 계산합니다. 스핀다운, 버퍼 및 트립신-EDTA를 제거하고 다시 일시 중단하여 2 x 106 셀/mL을 만듭니다. 시료당 세포의 500 μL.참고: 각 조건에 대해 최소 3개의 레이저 샘플을 만들고 3개의 레이저 컨트롤을 제어하지 않습니다. 4. IC-FPOP 수행 2개의 5 mL 주사기를 버퍼로 채우고, 500 μL 주사기는 세포와 함께 자석을 함유하고, 최종 500 μL 주사기를H2O2로채웁니다. 마그네틱 교반기의 켜기 220 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 담금질의 한 aliquot에 스파이크하고, 부드럽게 혼합하고, 조사된 샘플을 수집하기 위해 유량 시스템 뒤에 놓습니다. DMSO의 첨가는 내인성 메티오닌 설폭사이드 환원효소를 억제한다. 레이저를 켜고 7s를 기다린 다음 흐름 시스템을 켭니다. 샘플이 흐르는 것을 마치면 레이저를 끄고 채취한 샘플과 담금질을 부드럽게 섞습니다. 4.5 단계 와 4.6 단계에서 이 것을 옆으로 놓습니다. 세포가 매달려 있는 버퍼로 네 개의 주사기를 모두 채우고 흐름 시스템을 통해 흐르게 합니다. 시스템이 플러싱을 마친 후 4.1 단계와 4.2단계를 반복합니다. 조사 없이 흐름을 시작합니다. 이것은 세포에 있는 배경 산화를 설명하기 위하여 아무 레이저 통제입니다. 다음 샘플이 실행되는 동안, 5 분 동안 450-800 x g에서 이전 샘플을 스핀 다운, 용매를 제거하고, 방사성 면역 침전 분석 (RIPA) 버퍼와 같은 세포 용해 버퍼의 100 μL에서 다시 중단. 샘플을 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 액체 질소에서 플래시 동결합니다. 모든 시료 가동이 완료되면 세척을 위해 유량 계통을 분해합니다. 사용 된 실리카 튜브를 버리고 50 % 물에서 1 시간 동안 초음파 처리하여 다른 모든 연결을 청소하십시오 : 50 % 메탄올. 제조업체의 지침에 따라 주사기를 청소하십시오. 5. 다이제스트 전체 세포 가해를 소화합니다. 샘플을 해동하고 95 °C에서 10 분 동안 가열하여 시작합니다. 가열 후, 15 분 동안 얼음에 용해식을 식힙니다. DNA와 RNA를 소화하기 위해 25 단위의 뉴클레아아제와 방 온대에서 15 분 동안 배양하십시오. 4 °C에서 10 분 동안 16,000 x g에서 테이블 톱 원심 분리기를 사용하여 샘플을 스핀합니다. 상급체를 수집하고 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 옮김. 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 확인합니다. 20-100 μg의 샘플을 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 옮기고 100 μL로 가져옵니다. 50°C에서 20 mM dithiothreiotol(DTT)으로 시료를 45분 동안 줄입니다. 샘플을 실온에서 15분간 식힙니다. 실온에서 20 mM 요오도아세타미드 (IAA)를 20 분 동안 빛으로부터 보호합니다. 1:4 비율 단백질인 아세톤에 미리 차가운 아세톤을 추가합니다. 샘플을 섞고 -20°C에서 하룻밤 사이에 놓습니다. 다음날 아침, 4°C에서 10분 동안 16,000 x g에서 샘플을 스핀합니다. 상급체를 제거하고 90% 미리 냉각된 아세톤의 50 μL을 추가합니다. 샘플을 혼합하고 4 °C에서 5 분 동안 16,000 x g에서 스핀 다운하십시오. 아세톤을 제거하고 미세 원심 분리기의 뚜껑을 열어 놓고 상단을 덮는 보풀이없는 물티슈로 샘플을 건조시십시오. 시료가 건조된 후, 10 mMTris 완충액 pH 8로 단백질 펠릿을 다시 중단합니다. 10 mM Tris 버퍼 pH 8의 40 μL에서 트립신 20 μg를 다시 중단하십시오. 트립신 2 μg를 추가합니다 (질량 : 1 트립신의 질량 비율 : 50 샘플). 밤새 37°C에서 샘플을 배양합니다. 다음날 아침 펩티드 분석을 사용하여 펩티드 농도를 확인한다. 펩타이드 분석에 대한 샘플을 제거한 후, 샘플에 포산산을 첨가하여 트립신 소화를 담금질합니다(최종 농도는 5% 포르믹산). 최종 펩타이드 농도가 결정되면, 각 시료의 10 μg를 깨끗한 미세원원지 튜브로 옮긴다. 이렇게 하면 각 샘플의 동일한 양을 분석할 수 있습니다. 진공 원심분리기를 사용하여 샘플을 건조시. 일단 건조되면 질량 분석 등급 0.1% 포매산의 20 μL로 다시 중단한다. 샘플을 자동 샘플러 바이알로 전송합니다. 6. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법 FPOP 수정을 현지화하려면 LC-MS/MS 분석을 사용하여 소화된 세포 용해를 분석합니다. 아세토니트릴(B)에서 물(A)에서 0.1% 포르믹산과 0.1%의 포르믹산의 이월상을 사용하십시오. 180 μm x 20 mm C18(5 μm 및 100 Å) 트래핑 컬럼에 0.5 μg의 샘플을 적재하고 샘플을 99%(A) 및 1% (B)로 15분 동안 세척합니다. 75 μm x 30cm C18(5 μm 및 125Å) 분석 컬럼을 사용하여 3%(B)에서 시작하여 0.300 μL/min의 유량으로 분석 분리 방법을 실행한 다음 1-2분에서 10%(B)로 램프합니다. 다음 경사로는 2-100분에서 2-100분에서 100%(B)로 100%(B)로 110-115분에서 100%(B)로 열을 청소합니다. M/z 스캔 범위가 375-1500인 MS 수집 방법을 60,000의 해상도로 설정합니다. 자동 게인 제어(AGC) 타겟을 5.0 x 105로 설정하고 최대 주입 시간은 50ms입니다. MS 획득 중에 1.2m/z의 절연 창과 4s의 사이클 시간을 가진 데이터 종속 수집(DDA)을 통한 격리를 위해 전하 상태 2-6의 전구체 이온을 선택합니다. 정규화된 에너지가 32%로 설정된 HCD 활성화를 위해 5.0 x10의 강도 임계값을 가진 펩타이드를 선택합니다. 60s에 대한 1 MS/MS 획득 후 펩티드를 제외. AGC 타겟이 5.0 x 104이고 최대 주입 시간은 35ms인 MS/MS 분해능을 15,000으로 설정합니다. 7. 데이터 처리 관련 단백질 데이터베이스 및 관련 다이제스트 효소에 대해 사용 가능한 단백질 분석 소프트웨어에서 RAW 파일을 검색합니다. 여기, 스위스-프로트 호모 사피엔스 데이터베이스와 트립신을 사용합니다. 전구체 질량을 설정하여 350~5,000Da와 10 ppm의 질량 허용 오차 사이를 검색합니다. 6 에서 144 잔기 사이의 펩티드 길이를 가진 절단 부위를 놓친 최대 1 이있을 수 있습니다. 이러한 제한은 데이터베이스 검색을 용이하게 합니다. 카르바미도메틸(+57.021)을 사용하여 단편 이온 최대 질량 내성을 0.02 Da로 설정하고 동적 변형으로 17개의 아미노산으로부터의 모든 FPOP변형(도 4)을 FPOP 변형을 검출하는 데 사용되는 단백질 분석 워크플로우의 예이다).참고: 세린과 스레오닌에 대한 FPOP 수정은 하이드록실 라디칼과의 낮은 반응성으로 인해 검색에 포함되지 않습니다. 1%와 5%의 잘못된 검색 률로 미끼 데이터베이스로 검색합니다. 파일 검색이 완료되면 FPOP 수정 의 정도를 계산합니다. 오픈 프로테오메 디스커버러 2.2, 수출 서열, 수정 위치, 단백질 수탁, 스펙트럼 파일, 전구체 풍부, 보존 시간 정보. 수학식 4에서 수정 정도를 계산합니다.변형된 EIC 영역은 하이드록실 라디칼 변형을 가진 특정 펩티드의 크로마토그래피 영역이다. EIC 영역은 특정 펩티드의 변형 및 변형되지 않은 영역 모두의 총 크로마토그래피 영역입니다. 산화의 정도는 조사 유무에 관계없이 샘플에서 계산됩니다. 시료생략 조사(control)는H2 O2노출 전후에 세포에 존재할 수 있는2 임의의 배경 산화를 차지한다. FPOP 특정 수정사항을 격리하는 데 도움이 되도록 조사 샘플에서 컨트롤이 차감됩니다.