JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetik

RNA-Seq Analizi ile İnsan Primer Keratinositlerin In Vitro Farklılaşmasının Karakterizasyonu

Published: May 16, 2020
doi:
10.3791/60905
, , ,
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences,Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center,Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics,Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

Summary

Burada sunulan kontak inhibisyonu ile insan primer keratinositlerin in vitro farklılaşması için adım adım bir prosedürdür ve rna-seq analizi ile moleküler düzeyde karakterizasyon uyguluyor.

Abstract

İnsan primer keratinositler genellikle epidermal farklılaşma ve ilgili hastalıklar üzerine çalışmalar için in vitro modeller olarak kullanılır. Çeşitli indüksiyon koşulları kullanılarak iki boyutlu (2D) batık şekillerde kültürlenmiş keratinositlerin in vitro farklılaşması için yöntemler bildirilmiştir. Burada tanımlanan kontak inhibisyonu ve RNA-seq tarafından sonraki moleküler karakterizasyon ile 2D in vitro keratinosit diferansiyasyon yöntemi için bir prosedürdür. Kısacası, keratinositler tanımlanmış keratinosit orta büyüme faktörleri ile tam olarak konca kadar takviye olarak yetiştirilir. Farklılaşma keratinositler arasındaki yakın temaslar tarafından indüklenen ve daha fazla orta büyüme faktörleri hariç uyarılır. RNA-seq analizleri kullanılarak, her iki 1) farklılaştırılmış keratinositlerin farklılaşma sırasında farklı moleküler imzalar gösterdiği ve 2) dinamik gen ekspresyonu deseni epidermal tabakalaşma sırasında hücrelere büyük ölçüde benzediği gösterilmiştir. Normal keratinosit farklılaşmasına karşılık gelince, transkripsiyon faktörü p63 mutasyonlarını taşıyan keratinositler, farklılaşma kusurları ile uyumlu morfoloji ve moleküler imzalar sergilerler. Sonuç olarak, bu protokol 2D in vitro keratinosit farklılaşması ve moleküler karakterizasyonu için adımları ayrıntıları, RNA-seq verilerin biyoinformatik analizi üzerinde durularak. RNA çıkarma ve RNA-seq yordamları iyi belgelenmiş olduğundan, bu protokolün odak noktası değildir. İn vitro keratinosit farklılaşması ve biyoinformatik analiz boru hattının deneysel prosedürü, sağlıklı ve hastalıklı keratinositlerde epidermal farklılaşma sırasında moleküler olayların incelenmesinde kullanılabilir.

Introduction

İnsan derisinden elde edilen insan birincil keratinositler genellikle epidermisin biyolojisi çalışmak için hücresel bir model olarak kullanılır1,2,3,4. Epidermisin tabakalaşması keratinosit farklılaşması ile modellenebilir, ya 2D batık monolayer moda veya 3D hava asansörü organotipik model2,3,5,6,7. Epidermal yapı ve fonksiyonu değerlendirmek için 3D modeller giderek daha önemli hale gelmiş olsa da, 2D farklılaşma modelleri, kolaylıkları ve analizler için çok sayıda hücre üretme olasılığı nedeniyle hala yaygın olarak kullanılmaktadır.

Serum eklenmesi, yüksek kalsiyum konsantrasyonu, düşük sıcaklık ve epidermal büyüme faktörüreseptörlerinininhibisyonu 2 ,3dahil olmak üzere, 2D keratinosit farklılaşmasıinin indüklemesi için çeşitli koşullar uygulanmıştır. Bu yöntemlerin her biri keratinosit farklılaşma belirteç genleri bir dizi tarafından doğrulanmış ve patolojik koşullar altında da dahil olmak üzere keratinosit farklılaşması değerlendirilmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Ancak, bu indüksiyon koşulları da marker genlerin belirli paneller incelendiğinde onların farklılaşma verimliliği ve kinetik farklılıkları göstermektedir2,3.

Bu yöntemlerden biri keratinosit kontak inhibisyonu ve kültür ortamı nda büyüme faktörlerinin tükenmesi içerir8. Bu keratinositler hücreler tam yoğunluğa ulaştığında kendiliğinden ayırt edebilirsiniz gösterilmiştir.  Kültür ortamındaki büyüme faktörlerinin dışında kılması farklılaşmayı daha da artırabilir. Temas inhibisyonu ve büyüme faktörlerinin tükenmesini birleştiren yöntem, çeşitli epidermal belirteçler kullanırken normal tabakalı epidermis benzer gen ekspresyonu desenleri ile farklılaştırılmış keratinositler oluşturmak için gösterilmiştir3, Bu model normal keratinosit farklılaşması için uygun olduğunu düşündürmektedir. Son zamanlarda, bu modeli kullanarak keratinosit farklılaşması iki kapsamlı gen ekspresyonu analizleri bildirilmiştir9,10. Araştırmacılar bu modeli moleküler düzeyde doğruladı lar ve normal ve hastalıklı keratinosit farklılaşmasını incelemek için kullanılabileceğini gösterdiler.

Bu protokol, in vitro diferansiyasyon yöntemi ve RNA-seq kullanarak farklılaşmış hücrelerin moleküler analizi için prosedürü açıklar. Ayrıca, farklılaşma günü 0 (proliferasyon aşaması), 2. gün, 4. Diferansiye keratinositlerin epidermal tabakalaşma sırasında hücrelere büyük ölçüde benzeyen gen ekspresyonu desenlerini gösterdiği gösterilmiştir. Bu yöntemin deri patolojisi üzerinde çalışılıp kullanılamayacağını incelemek için, ektoderaktili, ektodermal displazi ve yarık dudak/damak (EEC) sendromu11,12olan hastalardan elde edilen transkripsiyon faktörü p63 mutasyonlarını taşıyan keratinositleri araştırmak için aynı deneysel ve analiz boru hattını uyguladık. Bu protokol, keratinositlerin in vitro farklılaşmasına ve rna-seq’nin sonraki biyoinformatik analizine odaklanır. RNA çıkarma, RNA-seq numune hazırlama ve kütüphane inşaatı gibi komple yordamdaki diğer adımlar iyi belgelenmiştir ve özellikle yaygın olarak kullanılan birçok ticari kit kullanılırken kolayca takip edilebilir. Bu nedenle, bu adımlar yalnızca kısa bir süre protokolü açıklanır. Veriler, bu boru hattının sağlıklı ve hastalıklı keratinositlerde epidermal farklılaşma sırasında moleküler olayların incelenmesi için uygun olduğunu göstermektedir.

Protocol

Deri biyopsileri sağlıklı gönüllülerin veya p63 mutasyonu olan hastaların gövdesinden alınarak primer keratinosit kültürünü nisabı kültürü ne şr; Radboud Üniversitesi Nijmegen Tıp Merkezi (“Komiser Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen”) etik komitesi tarafından insan birincil keratinositlerin kurulmasına ilişkin tüm prosedürler onaylanmıştır. Bilgilendirilmiş onay alındı. 1. Temas inhibisyonu ile insan primer keratinosit farklılaşması Gerektiğinde…

Representative Results

Normal keratinosit farklılaşması ve RNA-seq analiziBu deneyde, beş kişiden elde edilen keratinosit çizgileri farklılaşma ve RNA-seq analizleri için kullanılmıştır. Şekil 1, farklılaşma ve RNA-seq analizi sonuçlarının deneysel prosedürünü özetler. Normal keratinositlerin in vitro farklılaşma prosedürlerine genel bir bakış ve farklılaşma sırasında hücre morfolojisi değişiklikleri Şekil 1A’dagösterilmiştir….

Discussion

Bu çalışma, RNA-seq analizleri kullanılarak insan keratinosit farklılaşması ve sonraki karakterizasyonu indükleyen bir yöntemi açıklamaktadır. Mevcut literatürde, insan keratinosit farklılaştırma üzerinde birçok çalışma, yüksek kalsiyum konsantrasyonu veya serum ile farklılaşmaiknayöntemleri olarak iki diğer yöntemler kullanın 2,3,23. Bir önceki rapor dikkatle bu üç farklı yöntem<sup class="xref"…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) tarafından desteklenmiştir. (NWO/ALW/Açık Rekabet/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud Üniversitesi bursu (H.Z.); ve Çin Burs Konseyi hibe 201406330059 (J.Q.).

Materials

Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
  13. . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
  14. Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
  15. . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
  16. . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
  33. . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
  34. . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)

Tags

In VitroKeratinocyte DifferentiationRNA-seq2D MonolayerProliferation MediumDifferentiation MediumCell Seeding DensityRNA IsolationCDNA ConversionLibrary PreparationNext-generation SequencingRead MappingDESeq2RLD NormalizationVST Normalization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Smits, J. G., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image