Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse
Summary
Hier wird ein schrittweises Verfahren zur In-vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch Kontakthemmung dargestellt, gefolgt von einer Charakterisierung auf molekularer Ebene durch RNA-seq-Analyse.
Abstract
Humane primäre Keratinozyten werden oft als In-vitro-Modelle für Studien über epidermale Differenzierung und verwandte Krankheiten verwendet. Es wurden Methoden zur In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten berichtet, die in zweidimensionalen (2D) untergetauchten Weisen unter Verwendung verschiedener Induktionsbedingungen kultiviert wurden. Hier wird ein Verfahren zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierungsmethode durch Kontaktinhibition und anschließende molekulare Charakterisierung durch RNA-seq beschrieben. Kurz gesagt, Keratinozyten werden in definierten Keratinozyten Medium mit Wachstumsfaktoren ergänzt, bis sie vollständig konfluent sind angebaut. Die Differenzierung wird durch enge Kontakte zwischen den Keratinozyten induziert und durch den Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Medium weiter stimuliert. Anhand von RNA-Seq-Analysen wird gezeigt, dass beide 1) differenzierten Keratinozyten während der Differenzierung unterschiedliche molekulare Signaturen aufweisen und 2) das dynamische Genexpressionsmuster bei der epidermalen Schichtung weitgehend Zellen ähnelt. Was den Vergleich mit der normalen Keratinozytendifferenzierung betrifft, so weisen Keratinozyten, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, veränderte Morphologie und molekulare Signaturen auf, die mit ihren Differenzierungsfehlern übereinstimmen. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und deren molekulare Charakterisierung, wobei der Schwerpunkt auf der bioinformatischen Analyse von RNA-seq-Daten liegt. Da die RNA-Extraktion und die RNA-Seq-Verfahren gut dokumentiert sind, steht dieses Protokoll nicht im Mittelpunkt. Das experimentelle Verfahren der In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und bioinformatischen Analyse-Pipeline kann verwendet werden, um molekulare Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten zu untersuchen.
Introduction
Menschliche primäre Keratinozyten, die von der menschlichen Haut abgeleitet werden, werden oft als zelluläres Modell verwendet, um die Biologie der Epidermis1,2,3,4zu studieren. Die Schichtung der Epidermis kann durch Keratinozytendifferenzierung modelliert werden, entweder in 2D-Unterschicht-Manier oder 3D-Luftlift-Organotypikmodell2,3,5,6,7. Obwohl 3D-Modelle für die Bewertung der epidermalen Struktur und Funktion immer wichtiger geworden sind, sind 2D-Differenzierungsmodelle aufgrund ihrer Bequemlichkeit und der Möglichkeit, eine große Anzahl von Zellen für Analysen zu generieren, immer noch weit verbreitet.
Verschiedene Bedingungen wurden angewendet, um Keratinozytendifferenzierung in 2D zu induzieren, einschließlich Zugabe von Serum, hoher Kalziumkonzentration, niedrigerer Temperatur und Hemmung der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren2,3. Jede dieser Methoden wurde durch eine Reihe von Keratinozyten-Differenzierungsmarkergenen validiert und erwies sich als wirksam bei der Beurteilung der Keratinozytendifferenzierung, auch unter pathologischen Bedingungen. Diese Induktionsbedingungen zeigen jedoch auch Unterschiede in ihrer Differenzierungseffizienz und Kinetik, wenn bestimmte Panels von Markergenen untersucht werden2,3.
Eine dieser Methoden beinhaltet Keratinozytenkontakthemmung und Erschöpfung der Wachstumsfaktoren im Kulturmedium8. Es hat sich gezeigt, dass Keratinozyten spontan unterscheiden können, wenn Zellen die volle Dichte erreichen. Der Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Kulturmedium kann die Differenzierung weiter verstärken. Die Methode, die Kontakthemmung und erschöpfende Wachstumsfaktoren kombiniert, hat gezeigt, dass sie differenzierte Keratinozyten mit Genexpressionsmustern erzeugt, die der normalen geschichteten Epidermis ähneln, wenn mehrere epidermale Marker verwendet werden3, was darauf hindeutet, dass dieses Modell für die Untersuchung der normalen Keratinozytendifferenzierung geeignet ist. Kürzlich wurden zwei umfassende Genexpressionsanalysen der Keratinozytendifferenzierung mit diesem Modell9,10berichtet. Die Forscher validierten dieses Modell auf molekularer Ebene und zeigten, dass es verwendet werden kann, um normale und kranke Keratinozytendifferenzierung zu untersuchen.
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur In-vitro-Differenzierungsmethode und molekularen Analyse differenzierter Zellen mit RNA-seq. Es veranschaulicht auch die Charakterisierung des Transkriptoms der Zellen am Differenzierungstag 0 (Proliferationsstadium), Tag 2, Tag 4 und Tag 7 (frühe, mittlere bzw. späte Differenzierung). Es wird gezeigt, dass differenzierte Keratinozyten Genexpressionsmuster aufweisen, die Zellen während der epidermalen Schichtung weitgehend ähneln. Um zu untersuchen, ob diese Methode für die Untersuchung der Hautpathologie verwendet werden kann, haben wir dieselbe experimentelle und Analyse-Pipeline eingesetzt, um Keratinozyten zu untersuchen, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, die von Patienten mit ektokaktischer, ektodermaler Displasie und Lip-Palate-Syndrom (EEC) abgeleitet werden11,12. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten sowie die anschließende bioinformatische Analyse von RNA-seq. Andere Schritte des gesamten Verfahrens wie RNA-Extraktion, RNA-seq Probenvorbereitung und Bibliotheksbau sind gut dokumentiert und können leicht befolgt werden, insbesondere bei verwendung samt vielen häufig verwendeten kommerziellen Kits. Daher werden diese Schritte nur kurz im Protokoll beschrieben. Die Daten zeigen, dass diese Pipeline für die Untersuchung molekularer Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten geeignet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Induktion der menschlichen Keratinozytendifferenzierung und anschließenden Charakterisierung mittels RNA-Seq-Analysen. In der aktuellen Literatur verwenden viele Studien zur Unterscheidung der menschlichen Keratinozyten zwei andere Methoden, mit einer hohen Kalziumkonzentration oder mit Serum als Methoden zur Differenzierung2,3,23. Ein früherer Bericht verglich diese drei verschiedenen …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) unterstützt. (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Stipendium der Radboud University (H.Z.); und Stipendium des Chinesischen Stipendienrates 201406330059 (J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
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