通过RNA-Seq分析，人类原主角细胞的体外分化特征

人类原发性角蛋白细胞来源于人类皮肤，常被用作细胞模型，研究表皮^{1、2、3、4的生物学}。表皮的分层可以通过角蛋白细胞分化进行建模，无论是2D水下单层方式，还是3D空气提升器官模型^{2、3、5、6、7。}虽然 3D 模型在评估表皮结构和功能方面变得越来越重要，但由于 2D 分化模型的便利性和生成大量用于分析的细胞的可能性，因此仍然广泛使用。

各种条件已应用于诱导角蛋白细胞分化的2D，包括血清的添加，高浓度的钙，较低的温度和抑制表皮生长因子受体^2，3。这些方法中的每一个方法都经过了许多角蛋白细胞分化标记基因的验证，并证明在评估角蛋白细胞分化（包括在病理条件下）是有效的。然而，当对标记基因的特定面板进行2、3的检查时，这些诱导条件也^{显示了其分化效率和动力学的差异}。

其中一种方法涉及角蛋白细胞接触抑制和消耗生长因子在培养媒介^8。研究表明，当细胞达到全密度时，角蛋白细胞可以自发分化。 将文化媒介中的增长因素排除在外，可以进一步增强差异化。将接触抑制和减损生长因子相结合的方法已被证明在使用多个表皮标记3时，产生^具有与正常分层表皮相似的基因表达模式的分化角蛋白细胞，表明该模型适合研究正常的角蛋白细胞分化。最近，利用该模型对角蛋白细胞分化进行了两次综合基因表达分析，^{结果报告了9、10。}研究人员在分子水平上验证了该模型，并表明它可用于研究正常和患病的角蛋白细胞分化。

本协议描述了使用RNA-seq进行体外分化方法和分化细胞分子分析的过程。它还说明了分化日（增殖阶段）、第2天、第4天和第7天（分别早期、中间和晚期分化）细胞转录组的特点。表明，分化的角蛋白细胞显示基因表达模式，在表皮分层期间，它们与细胞大体相似。为了研究这种方法是否可用于研究皮肤病理学，我们应用了相同的实验和分析管道，以研究携带转录因子p63突变的角蛋白细胞，这些突变来自结膜、异体发育不良和唇裂（EEC）综合征^11，12的患者。该协议侧重于角蛋白细胞的体外分化以及随后对RNA-seq的生物信息学分析。完整程序的其他步骤，如RNA提取、RNA-seq样品制备和库结构，都记录得很好，很容易遵循，尤其是在使用许多常用商业试剂盒时。因此，这些步骤仅在协议中简要说明。数据表明，该管道适用于研究健康与患病角细胞表皮分化期间的分子事件。