Micropatrón simple de células únicas sin litografía con plantillas de corte láser
Summary
Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.
Abstract
Las técnicas de micropatrón se han utilizado ampliamente en la biología celular para estudiar los efectos del control de la forma y el tamaño de las células en la determinación del destino celular a una sola resolución de celda. Las técnicas actuales de micropatrón de una sola célula de última generación implican litografía suave e impresión de microcontacto, que es una tecnología poderosa, pero requiere habilidades de ingeniería entrenadas y cierto soporte de instalaciones en microfabricación. Estas limitaciones requieren una técnica más accesible. Aquí, describimos un método simple y libre de litografía alternativo: patrón de células únicas basado en plantillas. Proporcionamos procedimientos paso a paso que incluyen diseño de plantillas, fabricación de hidrogel de poliacrilamida, incorporación de proteínas a base de plantillas y chapado y cultivo celular. Este método simple se puede utilizar para patrones de una matriz de hasta 2.000 celdas. Demostramos el patrón de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos únicos (hiPSC) con formas celulares distintas, de un cuadrado 1:1 a un rectángulo adulto similar a 7:1. Este patrón de una sola célula basado en plantillas es libre de litografía, técnicamente robusto, conveniente, barato y, lo que es más importante, accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado.
Introduction
La llegada de los hiPSC y el posterior desarrollo de protocolos para su diferenciación dirigida en diferentes tipos de células han hecho posible el estudio del desarrollo y la enfermedad a nivel molecular y específico del paciente, utilizando específicamente cardiomiocitos iPSC derivados del paciente (iPSC-CM) para modelar cardiomiopatías1,,2. Sin embargo, una limitación importante para estudiar el desarrollo y la fisiología utilizando el sistema iPSC y otros modelos in vitro es la ausencia de un microambiente estructurado. In situ, las celdas se someten a las restricciones de la matriz extracelular (ECM), así como de las celdas vecinas. La composición bioquímica particular y la rigidez de estos microambientes dictan la distribución espacial de las células, así como los factores disponibles para participar en la adhesión celular. Esto, a su vez, influye en las vías de señalización intracelular, la expresión génica y la determinación del destino celular. Por ejemplo, el iPSC-CM micropatrónizado en una forma de varilla similar a un adulto tiene una capacidad contráctile, flujo de calcio, organización mitocondrial, electrofisiología y formación de túbulostransversales 3. Por lo tanto, las propiedades del microambiente son integrales en la regulación de las funciones celulares.
Las técnicas anteriores de micropatrones se basaban en gran medida en la fotolitografía(Figura 1A). En esta técnica, una capa de polímero fotosensible, o fotorresistente, se hila sobre un sustrato plano de la solución para formar una película delgada de aproximadamente 1 m de espesor. A continuación, la luz ultravioleta (UV) se aplica sobre el fotorresistente a través de una máscara que contiene el patrón deseado. La exposición a la luz ultravioleta (UV) altera químicamente el fotorresistente modificando su solubilidad en su respectiva solución de desarrollo, transfiriendo el patrón deseado de la máscara al sustrato. Muchos métodos de micropatrones incorporan fotolitografía, ya que confiere nanómetro al control a nivel de micrómetro sobre el diseño de los patrones celulares. Sin embargo, el giro del fotorresistente es muy sensible a las impurezas, ya que las partículas de polvo más pequeñas interrumpirán la propagación de la solución en una película delgada. Por lo tanto, la fotolitografía debe llevarse a cabo en instalaciones no contaminadas, que son costosas de mantener y requieren conocimientos especializados especiales para su uso. Además, los productos químicos utilizados en la fotolitografía son a menudo tóxicos para las células y pueden desnaturalizar biomoléculas importantes. Por lo tanto, la fotolitografía plantea obstáculos significativos a la fabricación de micropatrones para aplicaciones biológicas convenientes.
En 1994, Whitesides y sus colegas4 superaron algunos de los desafíos asociados con la fotolitografía al ser pioneros en una colección de técnicas llamadas litografía blanda. En la litografía blanda, se utiliza una superficie microestructurada hecha con polidimetilsiloxano (PDMS), un material transparente similar al caucho, para generar un patrón de proteínas ECM4. Las técnicas litográficas suaves comunes incluyen impresión de microcontacto sin patrones microfluídicos. En la impresión de microcontactos, actualmente el método litográfico suave más popular, un sello PDMS recubierto con proteínas ECM transfiere el material a una superficie en las áreas contactadas por el sello(Figura 1B). En el patrón microfluídico, las microestructuras se diseñan sobre una superficie PDMS de tal manera que cuando el sello se presiona a un sustrato, se crea una red de microcanales, a través de los cuales se pueden suministrar fluidos a las áreas deseadas (Figura 1C)5. La litografía suave ofrece varios beneficios sobre la fotolitografía. Una vez que una oblea maestra está microfabricada, los sellos PDMS se pueden replicar fácilmente sin más empleo de instalaciones de salas limpias. Además, la ausencia de disolventes orgánicos en el proceso de litografía blanda permite la utilización de materiales poliméricos como el poliestireno, normalmente utilizado en el cultivo celular. Por último, el micropatrón mediante métodos litográficos suaves no se limita a superficies planas. Por lo tanto, la litografía suave aumenta la accesibilidad y la funcionalidad de la fabricación de micropatrones sobre la fotolitografía6. Sin embargo, la litografía blanda tiene inconvenientes significativos. Por ejemplo, todavía se requiere un paso inicial de grabado, utilizando fotolitografía, para microfabricar el sello. Además, el micropatrón mediante un sello PDMS está sujeto a variaciones en la calidad de la transferencia de proteínas en el sustrato6. Evitar estas discrepancias requiere optimización y coherencia en la presión aplicada al sello PDMS durante la transferencia de proteínas, de lo contrario la deformación y distorsión de los tamaños de entidad de los moldes PDMS pueden ocurrir6. También existe una gran preocupación de utilizar repetidamente PDMS debido a la absorción de moléculas pequeñas7.
Para evitar el uso de fotolitografías blandas y sellos PDMS, describimos un método de micropatrón de células únicas basado en plantillas y libre de litografía que supera muchos de los obstáculos asociados con la fotolitografía y la litografía suave. En este método, un hidrogel de poliacrilamida se utiliza como sustrato para la incorporación de proteínas ECM a base de plantillas, lo que permite el chapado selectivo de hiPSC-CM únicos. Esta técnica es altamente compatible con materiales poliméricos utilizados en condiciones clásicas de cultivo celular. Además, con una limpieza y un mantenimiento adecuados, las plantillas son reutilizables y resistentes a la degradación y absorción de proteínas durante el proceso de microfabricación. Por último, el proceso de patrón es técnicamente robusto, económico, personalizable y accesible para aquellos que no tienen habilidades especializadas de bioingeniería. Esta técnica de micropatrón basada en plantillas ha sido ampliamente utilizada en nuestras publicaciones recientes modelando cardiomiopatías variadas8,,9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos un método de micropatrón basado en plantillas libre de litografía que permite un patrón eficaz de las células adherentes. En este protocolo, demostramos el patrón de hiPSC-CM en diferentes relaciones longitud-anchura mediante el micropatrón de islas de proteína de matriz de membrana de sótano en hidrogeles de poliacrilamida con rigidez tisular fisiológica o patológicamente relevante o sustratos de elastómero a base de silicio. Este método es relativamente simple y altamente accesible para cualqui…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas postdoctorales del Stanford Child Health Research Institute (CHRI) y el Instituto Nacional de Salud (1F32HL142205-01) a S.L, el NIH Office of Director’s Pioneer Award (LM012179-03), el American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), el Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation, y la División de Medicina Cardiovascular de Stanford, el Departamento de Medicina a S.M.W , premios del Instituto Nacional de Salud (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) y el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco (TRDRP 27IR-0012) a J.C.W, el Premio de Becas Postdoctorales de la Asociación Americana del Corazón (AHA) (18POST34030106) a H.Y, y la beca Hengstberger a T.S. Agradecemos al Dr. Andrew Olsen, del Servicio de Microscopía de Neurociencia de Stanford, el apoyo a las imágenes confocales del hiPSC-CM micropatrónizado. Agradecemos a H.Y. por el primer diseño de plantilla, fabricación, micropatrón de célula única de iPSC-CM en el cubreobjetos recubiertos de hidrogel de poliacrilamida, y la imagen confocal preliminar de la estructura sarcomere de iPSC-CM micropatrónizados de una sola célula.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
Referenzen
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