Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Os neurônios simpáticos pós-ganglionários (simetrias) pertencem ao sistema nervoso autônomo (ANS) e têm múltiplos papéis importantes na resposta e regulação da homeostase do corpo independente da consciência. Por exemplo, o estresse estimula as simetrias e evoca a resposta de luta ou fuga que leva a um aumento na freqüência cardíaca, pressão arterial e sudorese. As SymNs são afetadas em múltiplas doenças humanas devido à genética, toxicidade/lesão, ou como acompanhantes de outras doenças. Um exemplo de neuropatia genética é o transtorno familiar Disautonomia (DF), onde uma grave desregulação de symNs causa crise disautônoma, evidente por sudorese, mancha da pele, ataques de vômito, hipertensão e ansiedade¹. Um exemplo de toxicidade é o tratamento quimioterápico, que tem sido relatado ter efeitos colaterais tóxicos nos neurônios autônomos². Sabe-se que a denervação autônoma e a hiper-inervação podem tanto levar, ou acompanhar, doenças como a doença de Parkinson ou a doença renal hipertensiva^3,4. Assim, poder realizar pesquisas e entender os mecanismos da biologia symN e defeitos no contexto da doença é benéfico para a busca de tratamentos novos e eficazes.

Anatomia
O sistema nervoso periférico se ramifica em divisões sensoriais e autônomas. Os nervos afetuosos do sistema nervoso sensorial são responsáveis pela sensação de dor e tato, enquanto a ANS é responsável por repassar informações de todos os órgãos para o cérebro. A ANS é dividida no sistema nervoso entérico, interiorizando o trato gastrointestinal, o sistema nervoso parassimpático, importante para o relaxamento, e o sistema nervoso simpático (SNS), importante para ativação/regulação dos órgãos. O SNS adapta um sistema de dois neurônios⁵. Axônios neurais simpáticos pré-ganglionic na medula espinhal primeiro projetam os gânglios simpáticos, onde os corpos de células símn pós-ganglionárias estão localizados. Esses neurônios então enviam projeções longas para inervar os tecidos alvo de cada órgão do corpo. Os sinais transmitidos por neurônios pré-ganglionics são colinérgicos, enquanto as símns pós-ganglionárias são adrenérgicas e, portanto, expressam a norepinefrina (NE) como seu principal neurotransmissor. Há poucas exceções notáveis de neurônios pós-ganglionários e simpáticos que são colinérgicos, incluindo os que inervam os vasos sanguíneos. Os neurônios pós-ganglionários adrenérgicos expressam as enzimas tyrosine hydroxylase (TH), aromático L-aminoácido decarboxylase (AAAD), dopamina β-hidroxilase (DBH) e monoamina oxidase (MAO-A), todas responsáveis pela geração e metabolização do NE. Além disso, expressam os transportadores de reciclagem ne e/ou receptores α-adrenérgicos receptor (ADRA2), receptor β-adrenérgico (ADR2B), transportador de norepinefrina (NET1) e transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).

Desenvolvimento
Durante o desenvolvimento embrionário, as simens são derivadas da crista neural (NC), que emerge entre o tubo neural e o ectoderme de sobreposição⁶, e pode se diferenciar em múltiplas linhagens celulares, incluindo melanócitos, osteoblastos, adiócitos, glia, neurônios entéricos, neurônios sensoriais e neurônios autônomos⁷. Células de crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que tomam várias rotas através do embrião. Nesta fase inicial do desenvolvimento do NC, as células expressam os marcadores SNAIL1/2, FOXD3 e SOX10^8,9,10,11. A rota de migração, juntamente com o local axial que eles adotam, determina o subtipo NC no qual eles se desenvolverão. Esses subtipos NC podem ser distinguidos por sua expressão genética hox específica: NCCs cranianos não expressam genes HOX, NCCs vagal expressam HOX 1-5, NCCs tronco expressam HOX 6-9, e NCCs sacral expressam HOX 10-11¹². Entre eles, os NCCs tronco são reconhecidos como a principal fonte de symNs. Os precursores do SymN expressam o fator de transcrição MASH1/ASCL1¹³, que promove a expressão de PHOX2B¹⁴ e INSM1¹⁵. A família GATA de fatores de transcrição é expressa durante o desenvolvimento solidário tardio. GATA2 e GATA3 são expressos nos symNs, que por sua vez ativa o DBH¹⁶. O fator de transcrição HAND2 também é importante para a expressão e manutenção do DBH e th¹⁷.

Os HPSCs (por exemplo, células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas) são uma poderosa ferramenta¹⁸ para recapitular paradigmas de desenvolvimento e gerar simns que podem ser empregados para a modelagem de doenças de vários distúrbios humanos. Assim, ao gerar symNs a partir de hPSCs, é fundamental seguir as diretrizes de desenvolvimento e avaliar a expressão de marcadores apropriados ao longo do processo de diferenciação.

Protocolo symN anterior
Poucos grupos de pesquisa relataram anteriormente a geração de symNs a partir de hPSCs^19,20,21. A comparação direta desses protocolos entre si e com o nosso foi revisada recentemente²². Em 2016²³, publicamos um protocolo de diferenciação para a geração de neurônios autônomos com caráter symN (Figura 1A). Este protocolo utilizou o meio baseado em KSR, que foi utilizado tanto na manutenção de hPSCs indiferenciados quanto na diferenciação celular. Além disso, os hPSCs foram mantidos em fibroblastos embrionários de camundongos (células alimentadoras de MEF). Utilizamos este protocolo e PSCs de pacientes com DF para modelar o transtorno²³. Em 2019, descrevemos uma versão mais detalhada deste protocolo mais antigo²⁴. Em resumo, o destino neural foi induzido pela inibição SMAD²⁵ para bloquear a sinalização TGF-β e BMP nos primeiros 2 dias. A ativação wnt usando CHIR99021 promoveu progenitores neurais para se tornarem células NC. No dia 11, as células foram classificadas pelo FACS para as populações CD49D⁺ ou SOX10^{+ 26,23}, que produziram cerca de 40% de eficiência de geração nc. Assim, a classificação foi necessária para garantir a eficiência e pureza para os próximos passos de diferenciação. Os NCCs foram mantidos e amplificados como esferóides com o tratamento combinado de FGF2 e CHIR. Após 4 dias, os esferóides NC de manutenção foram banhados e deram BDNF, GDNF e NGF para terminar a maturação symN. Embora esses simns expressem fortes marcadores de simegos como ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, os marcadores para simns mais maduros, incluindo a expressão do receptor de acetilcolina nicotínica (CHRNA3/CHRNB4) e transportador de vesícula (VMAT1/2), foram baixos mesmo após 70 dias de diferenciação. Os genes HOX neste protocolo não foram formalmente testados, e as propriedades neurais maduras, incluindo a atividade eletrofisiológica das células, não foram verificadas.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para gerar symNs(Figura 1B). Os HPSCs são mantidos em condições livres de alimentadores, em pratos revestidos de vitronectina (VTN), utilizando a mídia Essential 8 (E8)²⁷. A fórmula dos meios de diferenciação tem sido modificada a cada etapa, aumentando assim o percentual da população nc²⁸. A maturação symN pode ser feita em populações de NCC cd49D⁺/SOX10⁺ classificadas ou não classificadas em massa. Ambos mostram altos níveis de expressão de marcador symN até o dia 30. Além disso, os symNs gerados com este protocolo respondem ao registro eletrofisiológico e aos tratamentos com ativos e compostos inibidores symN.