Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

Postganglionic sympathische neuronen (symNs) behoren tot het autonome zenuwstelsel (ANS) en hebben meerdere belangrijke rollen in het reageren en reguleren van homeostase van het lichaam onafhankelijk van bewustzijn. Stress stimuleert bijvoorbeeld symnen en roept de vecht-of-vluchtrespons op die leidt tot een toename van hartslag, bloeddruk en zweten. Symns worden beïnvloed in veelvoudige menselijke wanorde toe te schrijven aan genetica, giftigheid/verwonding, of als metgezellen aan andere ziekten. Een voorbeeld van een genetische neuropathie is de kinderziekte Familiale Dysautonomia (FD), waar een ernstige dysregulatie van symns dysautonome crisis veroorzaakt, duidelijk door zweten, vlekken van de huid, braken aanvallen, hypertensie, en angst¹. Een voorbeeld van toxiciteit is chemotherapie behandeling, waarvan is gemeld dat toxische bijwerkingen hebben op autonome neuronen². Het is bekend dat autonome denerhonger en hyper-innervatie beide kunnen leiden tot, of begeleiden, ziekten zoals de ziekte van Parkinson of hypertensieve nierziekte^3,4. Dus, in staat zijn om onderzoek te doen en de mechanismen van symN biologie en gebreken in de context van de ziekte te begrijpen is gunstig voor het zoeken naar nieuwe en effectieve behandelingen.

Anatomie
Het perifere zenuwstelsel vertakt zich in zintuiglijke en autonome divisies. De afferente zenuwen van het zintuiglijke zenuwstelsel zijn verantwoordelijk voor het gevoel van pijn en aanraking, terwijl de ANS verantwoordelijk is voor het doorgeven van informatie van alle organen naar de hersenen. Het ANS is verdeeld in het enterische zenuwstelsel, waarbij het maag-darmkanaal, het parasympathische zenuwstelsel, dat belangrijk is voor ontspanning, en het sympathische zenuwstelsel (SNS), dat belangrijk is voor activering/regulatie van organen. De SNS past een twee-neuron systeem⁵. Preganglionic sympathische neurale axonen in het ruggenmerg eerste project aan de sympathische ganglia, waar postganglionic symN cel lichamen bevinden. Deze neuronen sturen dan lange projecties om de doelweefsels van elk orgaan in het lichaam innervate. Signalen overgedragen door preganglionic neuronen zijn cholinerge, terwijl postganglionic symNs zijn adrenergic en dus express noradrenaline (NE) als hun belangrijkste neurotransmitter. Er zijn enkele opmerkelijke uitzonderingen van postganglionic, sympathische neuronen die cholinerg zijn, met inbegrip van degenen innervating bloedvaten. Adrenerge postganglionic neuronen uitdrukken de enzymen tyrosine hydroxylase (TH), aromatische L-aminozuur decarboxylase (AAAD), dopamine β-hydroxylase (DBH), en monoamine oxidase (MAO-A), allemaal verantwoordelijk voor het genereren en metaboliseren NE. Voorts drukken zij de NE-recyclingtransporters en/of receptoren α-adrenerge receptor (ADRA2), β-adrenerge receptor (ADR2B), noradrenalinetransporter (NET1) en vesiculaire monoaminetransporter (VMAT1/2) uit.

Ontwikkeling
Tijdens de embryonale ontwikkeling symNs zijn afgeleid van de neurale crest (NC), die ontstaat tussen de neurale buis en overlaying ectoderm⁶, en kan zich onderscheiden in meerdere celgeslachten, met inbegrip van melanocyten, osteoblasten, adipocyten, glia, enterische neuronen, sensorische neuronen, en autonome neuronen⁷. Neurale crest cellen (NPC’s) zijn zeer migrerende cellen die verschillende routes door het embryo. In dit vroege stadium van nc-ontwikkeling drukken de cellen de markers SNAIL1/2, FOXD3 en SOX10^8,9,10,11uit . De migratieroute bepaalt samen met de axiale locatie die ze aannemen het NC-subtype waarin ze zich zullen ontwikkelen. Deze NC-subtypen kunnen worden onderscheiden door hun specifieke HOX-genexpressie: CranialN NPC’s drukken geen HOX-genen uit, vagalNcc’s express HOX 1-5, trunk NCCs express HOX 6-9 en sacrale NPC’s express HOX 10–11¹². Onder hen, stam NPC’s worden erkend als de belangrijkste bron van symNen. SymN precursoren uiten de transcriptiefactor MASH1/ASCL1¹³, die de expressie van PHOX2B¹⁴ en INSM1¹⁵bevordert . De GATA familie van transcriptie factoren wordt uitgedrukt tijdens de late sympathische ontwikkeling. GATA2 en GATA3 worden uitgedrukt in de symNs, die op hun beurt activeert DBH¹⁶. De transcriptiefactor HAND2 is ook belangrijk voor de expressie en het onderhoud van DBH en TH^17.

HPSCs (bijvoorbeeld embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) zijn een krachtig instrument¹⁸ om ontwikkelingsparadigma’s te recapituleren en symNs te genereren die vervolgens kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering van verschillende menselijke aandoeningen. Het genereren van symnen uit hPSCs is dus van cruciaal belang om ontwikkelingsrichtlijnen te volgen en de expressie van geschikte markeringen langs het differentiatieproces te beoordelen.

Vorig symN-protocol
Weinig onderzoeksgroepen hebben eerder gemeld de generatie van symN’s van hPSCs^19,20,21. De directe vergelijking van deze protocollen met elkaar en de onze werd onlangs herzien²². In 2016²³, publiceerden we een differentiatie protocol voor het genereren van autonome neuronen met symN karakter (Figuur 1A). Dit protocol gebruikte KSR-gebaseerd medium, dat werd gebruikt bij zowel het onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs als celdifferentiatie. Bovendien werden hPSC’s gehandhaafd op embryonale fibroblasten van muizen (MEF-feedercellen). We gebruikten dit protocol en PSC’s van patiënten met FD om de aandoening 23 te^modelleren. In 2019 beschreven we een meer gedetailleerde versie van dit oudere protocol²⁴. Samengevat werd het neurale lot veroorzaakt door dubbele SMAD-remming²⁵ om TGF-β en BMP-signalering in de eerste 2 dagen te blokkeren. WNT activering met chir99021 bevorderd neurale voorlopers om NC-cellen te worden. Op dag 11 werden cellen gesorteerd door FACS voor CD49D⁺ of SOX10⁺ populaties^26,23, wat ongeveer 40% NC-generatie efficiëntie opleverde. Zo was sorteren nodig om de efficiëntie en zuiverheid voor de volgende stappen van differentiatie te waarborgen. De NPC’s werden gehandhaafd en versterkt als sferoïden met de gecombineerde behandeling van FGF2 en CHIR. Na 4 dagen werden de NC sferoïden van onderhoud verguld en kregen BDNF, GDNF en NGF de symN rijping te voltooien. Hoewel deze symN’s sterke symN-markers zoals ASCL1, TH, DBH en PHOX2A uitten, waren markers voor meer volwassen symnen, inclusief expressie van de nicotinische acetylcholine-receptor (CHRNA3/CHRNB4) en blaastransporter (VMAT1/2), laag, zelfs na 70 dagen differentiatie. HOX-genen in dit protocol werden niet formeel getest en volwassen neurale eigenschappen, waaronder elektrofysiologische activiteit van de cellen, werden niet geverifieerd.

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het genereren van symNs (figuur 1B). HPSC’s worden onderhouden in feeder-vrije omstandigheden, op vitronectine (VTN)-gecoate gerechten, met behulp van Essential 8 (E8) media²⁷. De formule van de differentiatiemedia is in elk stadium gewijzigd, waardoor het percentage van de NC-populatie²⁸is verhoogd. De symN rijping kan worden gedaan op CD49D⁺/ SOX10⁺ gesorteerdof ongesorteerde bulk NCC populaties. Beide tonen hoge niveaus van symN marker expressie door dag 30. Bovendien reageren de symnen die met dit protocol worden gegenereerd, op elektrofysiologische opname en op behandelingen met symN-activator- en inhibitorverbindingen.