İnsan İdrar Türemiş Hücrelerden Elde Edilen Doğrudan Yeniden Programlanmış Miyotüplerde Ekson Atlama

Ulusal Nöroloji ve Psikiyatri Merkezi Etik Komitesi bu çalışmayı onayladı (onay kimliği: A2017-018, A2018-029). Tüm bireyler idrar sağlamadan önce bilgilendirilmiş onay verdi. Tüm deneyler ilgili yönerge ler ve yönetmelikler altında gerçekleştirilmiştir. 1. UDC’lerin izolasyonu ve birincil kültürü NOT: UDC’ler daha önce yayınlanmış bir protokol8,9,10 bazı değişiklikler ile göre izole edildi. Sterilize plastik şişelerde spontan micturition sırasında idrar örnekleri toplamak.NOT: Dış üretral deliğin sterilizasyonu gerekli değildir. Midstream idrar viral kontaminasyon riskini azaltmak için arzu edilir. Bir sonraki işlemden önceki stok süresi >1 saat ise, hücrenin canlılığını korumak için idrar örnekleri 4 °C’ye aktarılmalıdır. Ancak,çözünmez çökeltiler ortaya çıkabileceğinden <4 °C sıcaklıktan kaçınılmalıdır. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g tüm idrar numunesini santrifüj. Süpernatant aspire, tüp içinde 1 mL bırakarak. Kalan 1 mL idrarda peletleri ayrı ayrı askıya alın ve bunları tek bir 50 mL tüpte toplayın. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 99 mL PBS, %1 penisilin/streptomisin (P/S), 0,5 g/mL amphotericin B’den oluşan 10 mL yıkama tamponu ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj edin. Tüpte 0.2 mL bırakarak süpernatant aspire. Sodyum pirüuvat ve Ham’ın F-12 besin karışımı rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin ile desteklenen yüksek glikoz Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) bir 1:1 karışımı oluşan birincil orta 4,5 mL hücre peletre resuspend, hidrokortizon, epinefrin, T3, transferrin, tetrasikliniçermeyen fetal sığır serumu (FBS), %1 P/S ve 0.5 μg/mL amphotericin B. Jelatin kaplı altı kuyu plakası (her kuyunun toplam hacmi, 1,5 mL) üç kuyuda hücreleri tohum. Kültür 37 °C’de nemlendirilir ve %5 CO2 24 saat nemlendirilir. Sonraki 3 gün boyunca birincil ortam adedinin 1,5 mL’sini ekleyin. 4. günde, rekombinant insan EGF ile takviye büyüme ortamı 1.5 mL ile orta değiştirin, insülin, hidrokortizon, epinefrin, T3, transferrin, 15% tetrasiklin içermeyen FBS, 0.5% L-alanin-L-glutamin, 0.5% esansiyel olmayan amino asitler, ve 2.5 ng/ mL fibroblast büyüme faktörü-temel (bFGF), rekombinant insan trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), EGF, ve 1% P/S. Büyüme ortamını her gün değiştirin.NOT: UDC kolonileri bir hafta içinde görünür. UDC kültürü −90 konflufluent olduğunda, pbs ile orta ve yıkama hücreleri çıkarın, tüm hücreleri bölmek 0.25% tripsin-EDTA ve tohum 3.000-5.000 hücreleri / cm2 yeni bir jelatin kaplı 60 mm çanak üzerine (geçiş 1).NOT: UDC’ler sıvı nitrojende depolanabilir. UDC’ler genellikle 60 mm kültür çanasında −70 birleşme yle üç stok tüpe ayrılır. 2. Retroviral yapı POLIMERaz zincir reaksiyonu (PCR) ile MYOD1 (NM_002478.4) plazmidinin kodlama bölgesini yükseltin.NOT: MYOD1 amplifikasyonu için karışım ve termal döngücü için koşullar sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2’degösterilmiştir. MYOD1 dizisinin başarıyla yükseltilmelerini doğrulamak için amplifiye edilmiş PCR ürününün 1 μL’sini kullanarak yaklaşık 1.000 bp boyutunda tek bir bandı %0,7 agarose jel elektroforezi tespit edin. Temizleme kitini kullanarak PCR ürününü temizleyin ve konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile belirleyin. Karışımı, bir gecede 37 °C’de Tablo 3’te gösterildiği gibi, birden fazla klonlama bölgesinde enzim hedefli restriksiyon bölgelerinde tet-on sistemi ve püromisin dirençli genile retroviral vektörü sindirmek için kuluçkaya yatırın. Retroviral vektörün başarılı bir şekilde sindirilmiş olduğunu doğrulamak için sindirilmiş ürünün 1 μL’sini kullanarak tek bir bandı %0,7 oranında agarose jel elektroforezi saplayın. Sindirilmiş ürünü temizleme kitini kullanarak temizleyin ve spektrofotometre ile konsantrasyonunu belirleyin. Güçlendirilmiş MYOD1 parçasını (2.1−2.3 adımla üretilen) sindirilmiş retroviral vektöre klonlamak için (2.4−2.6 adımlarında üretilen) füzyon içi klonlama reaksiyonu gerçekleştirin. Tablo 4’tegösterildiği gibi reaksiyonu ayarlayın, 50 °C’de 15 dakika boyunca reaksiyonuyguluyorve sonra buza yerleştirin. Üreticinin talimatlarına göre E. coli yetkili hücreleri kullanarak dönüşüm gerçekleştirin(Malzeme Tablosu). 10 g/L bacto tripto tripto, 5 g/L bakto maya ekstresi, 5 g/L NaCl, 15 g/L bacto agar ve 50 mg/L ampisilinden oluşan lb kültür plakası üzerinde kültür oluşturarak dönüştürülmüş yetkili hücreleri seçin. LB kültür ortamında seçilen koloni ve kültürü bir gecede 37 °C’de 200 rpm’de bacto agar olmadan alın. PLAzmid saflaştırma kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak MYOD1-intaklanmışretroviral vektörleri arındırın ve spektrofotometre kullanarak ölçün. MYOD1’in, eklenen MYOD1 dizisi boyunca her iki tarafta da hedeflenen ileri ve ters astarlar tarafından yükseltilen PCR ürününün doğrudan sıralanmasıyla retroviral vektöre doğru şekilde yerleştirildiğinden onaylayın.NOT: FÜZYON klonlama başarılı olduğunda MYOD1 dizisi retroviral vektör dizileri arasında sıkışmış olarak saptayabilir. Retroviral üretim için, 10 cm kollajen kaplı plakalar ve DMEM’de FBS nemlendirilmiş FBS ve 24 saat için %5 CO2 ile 50.000 hücre/cm2’de ambalaj hücrelerini tohumlayın. Ambalaj hücreleri biraraya geldiğinde, 30 μg MYOD1-insertliretroviral vektörleri, 30 g ambalaj vektörünü ve hücre delici peptid(Malzeme Tablosu)içeren transfeksiyon reaktifini girdap yaparak karıştırın ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. 37 °C ve %5 CO2’denemlendirilmiş ambalaj hücreleri ve kültür ortamına kuluçkaya yatan karışımı ekleyin.NOT: Kollajen kaplama gereklidir. Transfeksiyon tohumlamadan sonra 24 saat veya daha fazla olabilir, çünkü paketleme hücreleri kültür plakasından kolayca çıkar. 4 saat veya bir gecede sonra, taze büyüme orta orta değiştirin. Viral supernatant toplamak ve cotransfection sonra 24 ve 48 h taze orta ile değiştirin ve supernatant birleştirir. Viral supernatant konsantre etmek için, konsantratör reaktif ve inkübat ile karıştırın 37 °C gecede, sonra 4 °C 45 dakika için 1.500 x g santrifüj. Retrovirüs supernatant’ı 0,45 m’lik gözenekler ile pvdf filtreden filtreleyin. Üreticinin talimatlarına göre nicel PCR kiti ve termal çevrim sistemi kullanarak retroviral vektörtt kontrol edin. Viral supernatant’ı küçük aliquotlara bölün ve -80 °C’de stoklayın. 3. UDC’lerde MYOD1-retroviral vektör ile enfeksiyon 3.000-5.000 hücre/cm2’de UDC’leri jelatin kaplı 60 mm çanak üzerine tohumlayın. 24 saat tohumlamadan sonra, 8 μg/mL konsantrasyonda hekzadimethrine bromür ekleyerek 200 enfeksiyon çokluğu yla çözülmüş retrovirüse (adım 2.21) bulaştırın. 37 °C ve %5 CO2’denemlendirilmiş 24 saatlik bir kuluçkadan sonra, MYOD1transduced hücreleri seçmek için kültür ortamını 1 μg/mL puromisin içeren taze büyüme ortamıyla değiştirin. Her gün orta değiştirin.NOT: MYOD1-pozitif hücreler seçilirken genellikle 1 μg/mL puromisin kullanılır. Uygun doz belirlenmelidir. Transfected olmayan hücreleri içeren bir plaka kullanın ve 3−5 gün içinde tüm hücreleri öldürür dozu seçin. MIOD1-pozitif hücreler puromisin ekledikten sonra 7−10 gün içinde seçilmelidir. MYOD1transduced UDC’ler sıvı nitrojende depolanabilir. 4. 3-deazaneplanocin A hidroklorür (DZNep) ile tedavi edilen MYOD1-transjenes UDC’lerin miyojenik farklılaşması NOT: Son zamanlarda, bu DZNep bildirilmiştir, bir histon metiltransferaz inhibitörü, önemli ölçüde MYOGENINekspresyonu teşvik edebilir , geç kas düzenleyici faktörlerden biri, ve aynı zamanda myotube farklılaşmayol 7. 3,5 x 104 hücre/cm2yoğunlukta kollajen kaplı kuyularda PLAKA MYOD1-transdükse UDCs . Kültür 37 °C ve %5 CO2’denemlendirilir. 24 saat sonra, l-alanin-L-glutamin, %5 at serumu, ITS takviyesi, 1 μg/mL doksisiklin ve 5 μM DZNep ile yüksek glukozlu DMEM’den oluşan büyüme ortamını farklılaştırma ortamına değiştirin.NOT: 10 mM DZNep çözeltisi -80 °C’de 3 ay saklanabilir. Bir buz çözme dondurucu kullanın ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri kaçının. Hem MYOD1 doksisiklin ve DZNep ile aktive proliferasyonu bastırmak ve UDCs miyojenik farklılaşması teşvik. Bu nedenle miyojenik farklılaşmain indüksiyonundan sonra doksisiklin ve DZNep eklenmesi önerilir. DZNep, MIYoD1-UDC’lerin doza bağımlı bir şekilde miyojenik farklılaşmasını teşvik eder. Öte yandan, yüksek konsantrasyonda sitotoksisite gösterir. Bu nedenle, miyojenik farklılaşma ve hücresel biyoyararlanım üzerindeki etkilerine bağlı olarak 1−10 μM arasında değişen Uygun DZNep konsantrasyonunu belirleyin. 3 gün sonra, DZNep olmadan taze diferansiyasyon ortamıiçin farklılaşma ortamını değiştirin. Daha sonra, her 3 günde bir orta değiştirin.NOT: UDC’ler birbiriyle kaynaşır ve farklılaşmadan sonraki 1−2 hafta içinde miyotüpler oluştururlar. 5. MYOD1dönüştürülmüş UDCs exon atlama NOT: Burada, hasta kaynaklı hücrelerde ekson atlamadeğerlendirmek için üç protokol açıklanmıştır: 1) ters transkripsiyoner polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) distrofin mRNA; 2) Batı leke tarafından geri distrofin protein sinyali semiquantification; ve 3) immünositokimya ile geri distrofin floresan sinyalinin yarı quantification. Tüm yöntemler doza bağımlı bir şekilde ekson atlama tespit edebilirsiniz. RT-PCR ile ekson atlama verimliliğinin değerlendirilmesi Farklılaşmadan sonra 7 gün dmd hastalarından alınan MYOD1dönüştürülmüş UDC’lere transfekt antisense oligonükleotid (ASO) transfeksiyon için, ASO, transfeksiyon reaktifini(Malzeme Tablosu)karıştırın ve diferansiyasyon ortasını 1−10 μM’lik son konsantrasyona kadarkarıştırın. ASO ile 72 saat kuluçkadan sonra, ASO olmadan ortayı taze farklılaşma ortamına değiştirin. ASO transfeksiyonundan 3−7 gün sonra, farklılaşma ortamını çıkarın ve PBS ile 1x yıkayın. Hücre lisis tamponu ekleyin, UDCs lyse ve bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak toplam RNA hasat. RNA konsantrasyonu spektrofotometre ile ölçün. PcRtüplerinde tek adımlı RT-PCR reaksiyonu için gerekli reaktifleri Tablo 5’e göre birleştirin. PCR tüplerini karışımla birlikte bir termocycler yerleştirin. Tablo 6’yagöre termocycler çalıştırın. Mikroçip elektroforezini gerçekleştirin ve aşağıdaki gibi azı yağı konsantrasyonu kullanarak ekson atlama verimliliğini hesaplayın.Exon atlama verimliliği (%) = atlanan bant / (atlanan bant + atlanan bant) x 100NOT: PCR ürünlerini kısa süreli depolama için 4 °C’de veya uzun süreli depolama için -20 °C’de buzdolabında saklayın. Batı lekeleme ile ekson atlama sonrası distrofin tespiti Transfect ASO ve kültür MYOD1-UDCs adımları 5.1.1 ve 5.1.2 göre. Ortamı her 3 günde bir değiştirin. 2 haftalık farklılaşmadan sonra, proteaz inhibitörleri içeren radyoimmünopreyağış (RIPA) tamponunu kullanarak kültürhücrelerinden toplam proteini ayıklayın. 4 °C’de 15 dakika boyunca 14.000 x g’de buz ve santrifüj üzerindeki lysates sonicate. Supernatant toplamak ve bir BCA protein tsay kiti kullanarak protein konsantrasyonlarını belirlemek. 0,5 mL’lik bir tüpe 15 μg toplam protein ekleyin ve proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu 10 μL’lik toplam hacme ekleyerek seyreltin. Tablo 7’degösterildiği gibi örnek arabellek, azaltıcı madde ve deiyonize su ekleyin. Hücre nin 10 dk boyunca 70 °C’de demesi. 8.95 g/L trisin, 6.06 g/L tris baz, 1.0 g/L sodyum dodecyl sülfat (SDS) içeren tris-asetat çalışan tamponu hazırlayın. Numuneyi (20 μL) tris-asetat %3−8 jel üzerine yükleyin ve 150 V’da 75 dakika elektroforez uygulayın. Metanol olmadan leketampon hazırlayın. PVDF membranı 20 s metanolde ve daha sonra kullanıma kadar (en az 10 dk) blottamponuna batırın. Mini jeller ve midi jeller kullanarak 8 x 12 cm kullanarak 6 x 8 cm boyutunda PVDF membran kesin. Blotlama kağıtlarını PVDF membranınkiyle aynı boyutta kesin ve kullanıma kadar bu lekeleri tamponunda bekletin. Elektroforezden sonra, jeli PVDF membranınkiyle aynı boyutta kesin ve jeli distile suda ıslatın. Lekeleme kağıtlarını, PVDF membranı ve jeli yarı kuru transfer aparatı üzerine yerleştirin(Şekil 1). 30 dk için 4 mA/cm2’de aktarın. Membranı 2x distile suyla durulayın. Birincil antikorlar olarak anti-distrofin (1:500) ve anti-α-tubulin (1:1.200) antikor hazırlayın. HrP konjuge anti-fare antikor (1:100) ikincil bir antikor olarak hazırlayın. Membranları birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın, yıkama tamponuyla yıkayın, ardından oda sıcaklığında otomatik bir Batı işleme cihazı(Malzeme Tablosu)kullanarak ikincil antikorla kuluçkaya yatırın.NOT: Anti-α-tubulin antikor genellikle yükleme kontrolü olarak kullanılır. 1:500 anti-distrofin ve 1:1.200 anti-α-tubulin antikorları dahil olmak üzere karışık primer antikor solüsyonlar, antikor reaksiyonu aynı anda yapıldığında iyi çalışır. Membranı distile suda durulayın. Kemilüminesans algılama reaktifi ve şarj-coupled cihaz (CCD) kamera tabanlı görüntüleyici kullanarak proteinleri algılayın. Verileri uygun yazılımı kullanarak analiz edin. İmmünositokimya ile ekson atlama sonrası distrofin insaptama UdC’leri 4.1−4.3 adımlarına göre kollajen kaplı 96 kuyu plakalı miyotubelara doğrudan yeniden programlayın. 5.1.2 ve 5.1.3 adımlarına göre ASO ve kültür MYOD1-UDC’leri transfect. 2 haftalık farklılaşmadan sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve 4 °C’de 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit le düzeltin. MYOD1-UDC’leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,1 nonionic deterjanda geçirin ve 37 °C’de 15 dakika boyunca keçi serumu olanlara bloke edin. Hücreleri bir gecede 4 °C’de birincil antikorla kuluçkaya yatırın. Hücreleri PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ikincil antikoriçerenleri kuluçkaya yatırın.NOT: Burada fare anti-distrofin (1:30) birincil antikor olarak kullanılır, anti-fare IgG ikincil antikor olarak kullanılır ve Hoechst (1:10.000) çekirdek boyama için kullanılır. Plakaları floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin ve aynı durumda her kuyuda floresan sinyalini otomatik olarak yarı ölçmek için bir analizör kullanın.