外子跳过直接重新编程的线管从人类尿衍生细胞获得
Summary
在本文中，我们描述了一个详细的协议，使用MYOD1– 转化的尿液衍生细胞有效建模Duchenne肌肉营养不良肌，以评估脱外器跳过后肌营养不良的mRNA和蛋白质水平的恢复。
Abstract
Duchenne肌肉营养不良症（DMD），一种渐进和致命的肌肉疾病，是由DMD基因突变引起的，导致肌营养不良蛋白的缺乏。迄今为止，我们已经完成了一项由研究人员发起的先人体研究，该研究基于系统注入容易外阴-53跳过的形态寡核苷酸。为了有效治疗DMD，在进行临床试验之前，用DMD患者衍生的体外检测来筛选药物和评估患者资格。最近，我们报道了一种新的MYOD1-转化的尿液衍生细胞（UDC），该细胞与组蛋白甲基转移酶抑制剂（3-deazaneplanocin A盐酸）一起处理，作为DMD的细胞模型。新的自体UDC可能显示DMD疾病特异性表型的表镜，导致精密药物在各种肌肉相关疾病中的应用。在本文中，我们描述了一个详细的协议，使用MYOD1转换的UDCs以及逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）、西印迹和免疫细胞化学来有效建模DMD肌肉细胞，以评估在外孔跳过后肌营养不良mRNA和蛋白质水平的恢复。
Introduction
Duchenne肌肉营养不良症（DMD），一种渐进的，致命的肌肉疾病，是由DMD基因的帧移突变引起的，导致缺乏肌营养不良蛋白1。抗意识寡核苷酸基外子跳过疗法被认为是DMD有希望的。这种疗法是基于通过改变mRNA前拼接来恢复DMD阅读框架2的重症DMD表型转换到较温和的贝克尔肌肉营养不良样表型。我们最近完成了基于磷质异体寡聚物（PMO）寡聚物（PMO）的反复静脉注射的首次人体研究，可诱导DMD中的外显子53跳过，并表现出出色的安全外形，有希望的疗效，和可接受的药代动力学参数（注册为UMIN：000010964和ClinicalTrials.gov：NCT02081625）3。
然而，为了开发经济高效治疗这种疾病，使用从DMD患者获得的原发性肌肉细胞进行体外测试对于进行临床试验之前的药物筛选和患者资格验证至关重要，以及反映外在医学试验4中外在疗法有效性的生物标志物。最近，我们报道了一种新技术，以开发患者特异性MYOD1-转化的尿液衍生细胞（UDC）5，6作为DMD7的主要多巴模型。5,6因此，要生成心肌，只需要从患者身上收集尿液，无需侵入性程序。在本文中，我们描述了一个详细的协议，使用MYOD1– 转换的UDCs与3-deazaneplanocin一种盐酸盐治疗，以评估恢复的肌营养不良mRNA和蛋白质后，外阴跳过。
Protocol
国家神经病学和精神病学中心伦理委员会批准了这项研究（批准 ID：A2017-018，A2018-029）。所有个人在提供尿液之前都给予知情同意。所有实验均根据相关准则和条例进行。 1. UdC的隔离和初级文化 注：UDC根据先前发布的协议88、9、109进行了隔离，10并进行了一些修改。 在消毒塑料瓶中自发进行体征时收集尿液样本。注：不需要对外部尿道孔进行灭菌。中流尿液是降低病毒污染风险的理想。如果下一次手术前的库存时间是 >1 h，尿样应转移到 4 °C 以保持细胞活力。然而，应避免温度 <4 °C，因为可能会出现不溶性沉淀物。 在室温下，将整个尿样在 400 x g下离心 10 分钟。 吸气上清剂，在管中留下1 mL。 在剩余的1 mL尿液中单独悬浮颗粒，然后在单个 50 mL 管中收集颗粒。 加入10 mL洗涤缓冲液，包括99毫升的PBS，不含钙和镁，1%青霉素/链霉素（P/S），0.5微克/mL安高霉素B，并在室温下以200 x g离心样品10分钟。 吸气上清液，在管中留下0.2 mL。 在4.5mL的初级介质中重新悬浮细胞颗粒，由高葡萄糖Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）的1：1混合物组成，不含丙酮钠和Ham的F-12营养混合物，补充重组人类表皮生长因子（EGF），胰岛素， 氢皮质酮、肾上腺素、T3、转移素、10%不含四环素的胎儿牛血清（FBS）、1%P/S和0.5微克/mL安高菌素B。 将细胞播种在三口明胶涂层的六个孔板（每个井的总体积，1.5 mL）。培养在37°C和5%CO2中加湿，24小时。 在接下来的 3 天内，每天添加 1.5 mL 的主介质。 在第4天，用1.5mL的生长介质代替介质，辅以重组的人类EGF， 胰岛素、氢皮质松、肾上腺素、T3、转移素、15%无四环素FBS、0.5%L-丙氨酸-L-谷氨酰胺、0.5%非必需氨基酸和2.5 ng/mL纤维细胞生长因子基本（bFGF）、重组人类血小板衍生生长因子（PDGF）、EGF和1%P/S. 每隔一天改变一次生长介质。注：UDC 菌落在一周内出现。 当UDC培养变为80-90%的汇积时，用PBS去除介质并洗涤细胞，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA和种子在3，000-5，000细胞/cm2下分裂所有细胞到新的明胶涂层60毫米盘中（通道1）。注：UDC 可以储存在液氮中。UDC 通常在 60 mm 培养盘中以 60-70% 的汇合度分为三个库存管。 2. 逆转录病毒结构 通过聚合酶链反应MYOD1（PCR）放大MYOD1（NM_002478.4）质粒的编码区域。注：MYOD1放大的混合物和热循环器的条件分别显示在表1和表2中。 使用放大 PCR 产物的 1 μL 检测约 1，000 bp 大小的单个波段，通过 0.7% 的琼脂胶电泳检测，以确认MYOD1序列已成功放大。 使用清洁套件清洁 PCR 产品，并使用分光度计确定其浓度。 如表3所示，在37°C过夜孵化混合物，在多克隆位点限制酶靶区使用Tet-on系统和紫杉霉素耐药基因消化逆转录病毒载体。 使用1 μL的消化产物检测单波段0.7%的琼脂胶电泳，以确认逆转录病毒载体被成功消化。 使用清洁套件清洁消化的产品，并通过分光度计确定其浓度。 要将放大的MYOD1片段（由步骤2.1_2.3生成）克隆到消化的逆转录病毒载体（由步骤2.4~2.6生成），执行融合内克隆反应。如表4所示，将反应置于50°C下15分钟，然后放在冰上。 根据制造商的说明（材料表），使用大肠杆菌能力细胞进行转化。 通过在由10克/升巴托锥酮、5克/升巴托酵母提取物、5克/L NaCl、15克/升巴托阿加和50mg/L安曲霉素组成的LB培养板上培养，选择转化的合格细胞。 在37°C下，在200 rpm下，在LB培养介质中选取选定的菌落和培养物，无百藤agar。 使用质粒净化试剂盒（材料表）净化MYOD1-插入的逆转录病毒载体，并使用分光光度计进行量化。 确认MYOD1通过直接测序 PCR 产物直接测序，通过插入的 MYOD1序列两侧的正向和反向引物放大，从而正确插入到逆转录病毒载体中。注：当融合克隆成功时，可以检测到MYOD1序列夹在逆转录病毒载体序列之间。 对于抗逆转录病毒生产，在10厘米胶原蛋白涂层板上以50，000细胞/cm2的包装细胞种子，并在DMEM中培养10%的FBS，在37°C和24小时加湿5%CO2。2 当包装细胞增殖至80%汇合时，混合MYOD1-插入的逆转录病毒载体30μg，30μg的包装载体，以及通过涡旋吸收含有细胞穿透肽（材料表）的转染试剂，并孵育10分钟。 将孵化混合物加入包装细胞的介质中，并在37°C和5%CO2下加湿。2注：胶原蛋白涂层是必要的。播种后24小时或更长时间的转染可能更好，因为包装细胞很容易从培养板分离。 4小时后或过夜后，将中度改为新鲜生长介质。 收集病毒上清液，并在24和48小时后用新鲜介质在共转后更换，并结合上清。 要浓缩病毒中清液，将其与集中剂试剂混合，并在37°C下孵育过夜，然后在1500 x g下以离心机在4°C下45分钟。 通过具有0.45 μm毛孔的PVDF过滤器过滤逆转录病毒上清。 根据制造商的说明，使用定量 PCR 套件和热循环器系统检查逆转录病毒载体的位机。 将病毒上清液分为小等号，并将其储存在-80°C。 3. 感染MYOD1- 抗逆转录病毒载体在UDC 在涂有3，000-5，000个细胞/cm2的3，000-5，000个细胞，在涂有60毫米的盘子上播种。 播种24小时后，在200μg/mL浓度的浓度下加入六氯苯甲酰胺溴，以200倍的感染倍数感染解冻的逆转录病毒（步骤2.21）。 在37°C和5%CO2下加湿24小时后，2用含有1μg/mL紫霉素的新鲜生长介质取代培养基，选择MYOD1-转导细胞。每隔一天更换一次介质。注：当选择MYOD1-正细胞时，通常使用1μg/mL紫霉素进行选择。应确定适当的剂量。使用含有未转染细胞的板，选择在3-5天内杀死所有细胞的剂量。MYOD1- 阳性细胞应在添加紫杉霉素后7~10天内选择。MYOD1-转导的UDCs可以储存在液氮中。 4. MYOD1- 用3-deazaneplanocinA盐酸盐（DZNep）处理的转导UdCs的成质分化 注：最近，有报道称DZNep，一种组蛋白甲基转移酶抑制剂，可以显著促进MYOGENIN的表达，这是晚期肌肉调节因素之一，也会导致肌管分化7。 板MYOD1- 胶原涂层孔中的转导 UdC，密度为 3.5 x 104细胞/厘米2。培养在37°C和5%CO2下2加湿。 24小时后，将生长介质转变为由高葡萄糖DMEM与L-丙氨酸-L-谷氨酰胺、5%马血清、ITS补充剂、1 μg/mL 多氧环素和5μM DZNep组成的分化介质。注：10 mM DZNep 溶液可在-80°C下储存3个月。使用除霜冷冻机，避免重复冻融循环。由多西环素和DZNep激活的MYOD1可抑制增殖，促进UdCs的成质分化。因此，建议在引入体源分化后添加多西环素和DZNep。DZNep以剂量依赖性的方式促进MYOD1-UDC的成性分化。另一方面，它显示了高浓度的细胞毒性。因此，根据DZNep对成质分化和细胞生物利用度的影响，确定其适当浓度，范围从1~10μM。 3天后，将分化介质更改为不含DZNep的新鲜分化介质。然后，每 3 天更改一次介质。注：UDC相互熔断，并在分化后1-2周内形成体管。 5. 在MYOD1- 转换的 UDC 中跳过 Exon 注：这里描述了三种协议来评估患者衍生细胞中的外子跳过：1） 肌营养不良mRNA的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）;1） 反核糖核酸mRNA的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）;2）西药菌恢复性肌肽蛋白信号半定量;3） 通过免疫细胞化学对恢复性肌阵子荧光信号的半定量化。所有方法都可以检测外子跳过剂量依赖的方式。 RT-PCR 对外子跳过效率的评估 将抗感觉寡核苷酸（ASO）转送到MYOD1-转换的UDCs中，在分化后的第7天从DMD患者那里获得，混合ASO、转染试剂（材料表）和分化介质，最终浓度为1~10μM。2 使用 ASO 孵育 72 小时后，将介质更改为不含 ASO 的新鲜分化介质。 从 ASO 转染后 3-7 天开始，去除分化介质，用 PBS 洗涤 1 倍。加入细胞水化缓冲液，将UdCS进行挤压，并使用RNA提取试剂盒收获总RNA。 使用分光光度计测量RNA浓度。 根据表5，将PCR管中一步RT-PCR反应所需的试剂组合起来。 将带混合物的 PCR 管放入热循环器中。根据表 6运行热循环器。 执行微芯片电泳，并使用如下摩尔浓度计算外子跳过效率。Exon 跳过效率 （%） = 跳过的频段 / （跳过的频带 = 非跳过的频段） x 100注：将 PCR 产品存放在冰箱 4°C，用于短期存储，或 -20 °C 长期储存。 经西方印迹跳过外显子后对肌肽的检测 根据步骤 5.1.1 和 5.1.2 进行转染 ASO 和培养MYOD1- UDC。 每 3 天更换一次介质。 经过2周的分化后，使用含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液从培养细胞中提取总蛋白。 在4°C下，在14，000 x g的冰上和离心机上对水合物进行15分钟的声波。 使用 BCA 蛋白质测定试剂盒收集上清液并确定蛋白质浓度。 在0.5 mL管中加入15μg的总蛋白质，通过将含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液加入10μL，稀释。 添加样品缓冲液、还原剂和去离子水，如表 7所示。在70°C下使细胞起水，变性10分钟。 制备含有8.95克/升三环、6.06 g/L 三酯基、1.0 g/L 硫酸钠（SDS）的三酸醋酸酯跑步缓冲液。 将样品 （20 μL） 加载到三酯酸 3+8% 凝胶上，并在 150 V 下进行电泳 75 分钟。 准备无甲醇的印迹缓冲液。 将 PVDF 膜浸泡 20 秒，然后浸泡在印迹缓冲液中，直到使用（至少 10 分钟）。使用迷你凝胶将 PVDF 膜切割到 6 x 8 厘米大小，使用中端凝胶将 PVDF 膜切割到 8 x 12 厘米。 将印迹纸切割到与 PVDF 膜相同大小，并将这些纸浸泡在印迹缓冲液中，直到使用为止。 电泳后，将凝胶切割到与PVDF膜相同的尺寸，并将凝胶浸泡在蒸馏水中。 将印迹纸、PVDF 膜和凝胶放在半干转移装置上（图 1）。在 4 mA/cm2下传输 30 分钟。 用蒸馏水冲洗膜 2 倍。 制备抗肌肽（1：500）和抗β-图布林（1：1，200）抗体作为主要抗体。 准备HRP结合的抗小鼠抗体（1：100）作为次要抗体。 用原抗体孵育膜，用洗涤缓冲液清洗，然后在室温下使用自动西处理装置（材料表）与二次抗体孵育。注：抗β-图布林抗体通常用作载荷控制。混合原抗体溶液，包括1：500抗迪斯特罗芬和1：1，200抗β-图布林抗体在抗体反应同时进行时工作良好。 用蒸馏水冲洗膜。 使用化学发光检测试剂和电荷耦合设备 （CCD） 相机成像仪检测蛋白质。 使用适当的软件分析数据。 免疫细胞化学在外显子跳过后对肌营养不良症的检测 根据步骤 4.1_4.3，将 UdC 直接重新编程到胶原蛋白涂层 96 孔板中的线管中。 根据步骤 5.1.2 和 5.1.3 对 ASO 和培养MYOD1- UPC 进行转染。 经过2周的分化后，用PBS清洗细胞，并在4°C下将其固定在4%的甲醛中10分钟。 渗透MYOD1- UPC 在室温下在 0.1% 的非离子洗涤剂中工作 10 分钟，并在 37°C 下将 10% 山羊血清阻拦 15 分钟。 在4°C下用原发抗体孵育细胞过夜。 用PBS清洗细胞，在室温下用二次抗体孵育细胞30分钟。注：在这里，小鼠抗性肌肽（1：30）用作主要抗体，反小鼠IgG用作继发抗体，Hoechst （1：10，000） 用于核染色。 使用荧光显微镜对板材进行成像，并使用分析仪在相同条件下自动对每口井的荧光信号进行半量化。
Representative Results
我们可以轻松、非侵入性地收集UdC。UDC在开始原生细胞培养后一周内形成菌落，我们观察到明显的增殖能力。UDC的培养是直接的，当手术正确执行时，细菌或真菌污染是罕见的。 图 2显示了原文化一周后 UDC 聚落的代表性相对比图像（图 2A）和MYOD1-UCC 在区分后一周（图 2B）。图 3显示了 RT-PCR 从 DMD 患者获得的 UDC 中外子跳过的成功检测。图3A显示了DZNep治疗MYOD1-UdC在DZNep治疗MYOD1-UdCS中抗感觉寡核苷酸治疗后肌营养不良肽的RT-PCR分析，该分析来自一名6岁男孩，在DMD基因中exon 45-54缺失。打开的阅读框架由 exon 44 跳过恢复。在分化后的第14天，我们确认以剂量依赖方式诱导外子跳过（图3B）。上带表示本机产品，下带表示恢复打开读取框的 44 跳过产品。 图 4显示了通过西药凝印从 DMD 患者获得的 DMD 中通过剂量依赖性检测获得的 UDC 中外显子跳过后，对肌营养不良症的成功检测。我们还使用免疫细胞化学检测了恢复性肌张力障碍的表达（图5）。在96井板上的抗感觉寡核苷酸（ASO）转染1周后，我们用荧光显微镜测量了肌肽的强度（图5A）。MYOD1- 使用ASO处理的UDC比在控制ASO处理的UPC中明显更高（图5B）。 这些结果表明，我们的新测定可以有效地评估在MYOD1- UDC中从DMD患者获得的mRNA和蛋白质水平的外子跳过。 图 1：半干西部印布传输堆栈的原理图表示。在负端放置了两份浸在印迹缓冲液中的纸张，两份浸在缓冲液中的纸张被堆放在上面。凝胶被浸泡在缓冲液中，轻轻放在PVDF膜上。请点击此处查看此图形的较大版本。 图 2：UdC 的代表性图像。（A） 在初级文化一周后，UdC 的相位对比图像。比例尺 = 200 μm. Inset：白色矩形中区域的放大图像。（B） MYOD1的相位对比度图像 – 分化后一周的 UdC。刻度柱 = 50 μm。这个数字是从田泽等人7号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。 图3：通过RT-PCR从DMD患者获得尿源细胞（UPC）外导跳的成功评估。（A） RT-PCR分析后抗感觉寡核苷酸治疗后，在3-deazaneplanocin A盐酸盐 （DZNep） – 治疗MYOD1- UDC派生从杜琴肌肉营养不良症 （DMD） 患者与外阴 45-54 删除.DZNep处理MYOD1-UDC也以1-10μM浓度的控制抗义作为对照处理。上带是未跳过的产品（Ex 45-54 删除），这些产品仍不在读取帧中。下带是恢复打开读取帧的 Exon 44 跳过产品（Ex 44-54 删除和 Ex 44 跳过）。（B） 跳过效率计算为 （exon 44 跳过的转录摩尔性）/（本机 = exon 44 跳过的转录记录器摩尔度 [用箭头标记]） x 100% 使用微芯片电泳系统。单向 ANOVA 后跟 Bonferroni 的后临时测试用于比较跳过效率（每个组为 n = 3，+P < 0.0001）。数据表示为均值 = SEM。这个数字是从田泽等人7号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。 图4：西方斑点对DMD患者尿源细胞（UMC）外在跳外子的成功评估。（A） DZNep 治疗MYOD1- DMD 患者的肌营养不良症代表西发性斑点，外音 45-54 在 exon 44 跳过后删除。对于肌营养不良素检测，使用了抗肌营养不良素（针对C-终端）。（B） 通过执行单向ANOVA后邦费罗尼的后临时测试（每组为+P=lt; 0.01，[P< 0.01，[P < 0.001，+P < 0.001，HI = 健康个体），在具有或没有抗感觉寡核苷酸治疗的患者衍生细胞中，对带子的相对强度进行了比较。这个数字是从田泽等人7号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。 图5：DZNep治疗MYOD1-UDC治疗DMD患者的抗感觉寡核苷酸治疗后，用于肌张力障碍的免疫细胞化学热图，exon 45-54缺失。（A） 删除外子 45-54 恢复基于 exon 跳过 exon 44 的开放式阅读框架。（B） 信号强度在96井板上发生抗感觉寡核苷酸转染1周后，使用荧光显微镜进行量化。单向ANOVA后，邦费罗尼的后临时测试用于比较（n = 3-4 每组，+P < 0.0001）。这个数字是从田泽等人7号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。 试剂 体积 最终浓度 2x PCR 预混 12.5 μL 1 倍 正向引漆 5 pmol 0.2 μM 反向引漆 5 pmol 0.2 μM 模板 80 纳克 消毒蒸馏水 高达 25 μL 每次反应的总体积 25 μL 表1：通过RT-PCR进行MYOD1扩增的混合物。 98 °C 10 s 55 °C 10 s • 35 个周期 72 °C 10 s 表2：MYOD1扩增热循环器的条件。 试剂 体积 10x K 缓冲器 2 μL 逆转录病毒载体（500纳克/μL） 2 μL 限制性酶 1 （2~15 U） 1 μL 限制性酶 2 （2~15 U） 1 μL 消毒蒸馏水 14 μL 总容量 20 μL 表3：用于消化逆转录病毒载体的管的混合物。 试剂 体积 纯化 MYOD1 片段 100 ng 消化性逆转录病毒载体 100 ng 5x 酶预混合 4 μL 消毒蒸馏水 高达 20 μL 总容量 20 μL 表4：融合克隆反应的混合物。 解决 方案 体积/反应 （μL） 最终浓度 无无纳塞水 变量 – 一步 RT-PCR 缓冲区 4 1 倍 dNTP 混合（包含每个 dNTP 的 10 mM） 0.8 每部 dNTP 的 400 mM 正向底漆 （10 mM） 1.2 0.6 mM 反向底漆 （10 mM） 1.2 0.6 mM 一步 RT-PCR 酶混合物 0.8 – RNase抑制剂（可选） 变量 5~10个单位/反应 模板RNA 50~400纳克 总容量 20 表5：一步RT-PCR一次反应的必要化合物。 1 个周期 反向转录 30分钟 50 °C 1 个周期 初始 PCR 激活步骤 15分钟 95 °C 1 个周期 变性 1 分钟 94 °C 退火 1 分钟 60 °C 扩展 1 分钟 72 °C 1 个周期 最终扩展 7分钟 72 °C 保持 ∞ 4 °C 表 6：一步 RT-PCR 的热循环器条件。 试剂 体积 蛋白质 （15 μg） 10 μL 样品缓冲器 （4x） 5 μL 还原剂（10 倍） 2 μL 去离子水 3 μL 总容量 20 μL 表7：制备硫酸钠多丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的样品。
Discussion
在这里，我们描述了从DMD患者获得的MYOD1转换的UdCS中外子跳过的详细协议。使用检测系统，我们有效地筛选了最佳的抗感觉序列。我们假设MYOD1转换的UDCs可用于研究这种疾病的病理生理学。
评估在mRNA水平使用患者衍生细胞跳过的外子是进行临床试验之前筛选新药和评估患者资格所必需的。外子跳过效率的计算只能在mRNA水平上进行评估。
评估外子跳过在蛋白质水平也很重要，因为肌营养不良蛋白恢复是重要的替代生物标志物，以预测外子跳过的好处。迄今为止，抗感觉寡核苷酸序列的筛选通常使用原发性肌肉细胞系或永生的肌细胞系（包括人类坏死肌瘤（RD）细胞进行，但我们不能用肌肉细胞系或RD细胞系测量肌营养不良素水平的恢复，因为它们以内代方式表达这种蛋白质。我们可以清楚地检测DMD患者衍生MYOD1-UPC中肌营养不良啡的恢复，以剂量依赖的方式。在我们的新测定中，我们认为西方印迹对还原蛋白的评估在可量化性上是优越的。另一方面，使用96孔板进行免疫细胞化学评价是同时筛选许多候选化合物的理想选择。
在本文中，我们描述了一个详细的协议，用于使用MYOD1转换的UDCs以及RT-PCR、西印迹和免疫细胞化学进行有效建模DMD肌肉，以评估在mRNA恢复的肌营养不良蛋白和外子跳过后的蛋白质水平。UDC 可以非侵入性且易于收集。因此，我们假设全新的体外测定可以应用于广泛的基础和转化研究，而不管肌肉疾病的类型如何。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了日本促进科学研究资助协会（C）的支持[给予Y.A.18K07544号]， 神经和精神障碍研究补助金[给予Y.A.第28-6号]和日本医学研究开发机构[授予号18ek0109239h0002，18lm0203066h0001，18lm0203069h0001给Y.A.]。
Materials
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
Referenzen
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 (2011).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Antoury, L., et al. Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies. Nature Communications. 9, 3906 (2018).
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- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9, 3807 (2019).
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- Chen, W., et al. Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).
- Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease. Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).
Diesen Artikel zitieren
Takizawa, H., Sato, M., Aoki, Y. Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells. J. Vis. Exp. (159), e60840, doi:10.3791/60840 (2020).