Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma
Summary
Fare sperm kapamanı sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü uygulamasını tanımladık.
Abstract
Memeli spermleri kapacitation olarak bilinen bir süreç içinde kadın üreme sisteminde döllenme kapasitesi elde. Kapacitation ile ilişkili süreçler enerji gerektirir. Sperm progresif hareketliliği, kapasitasyon, hiperaktivasyon ve akrozom reaksiyonunu besleyen ATP’yi üreten kaynaklar hakkında devam eden tartışmalar devam etmektedir. Burada, fare sperm kapamanı sırasında enerji metabolizmasındaki değişiklikleri analiz etmek için bir araç olarak hücre dışı akı analizörü uygulaması açıklar. H+ve O2– hassas floropores kullanarak, bu yöntem glikoliz ve oksidatif fosforilasyon un kapasitif olmayan ve kapasitif sperm gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlar. Farklı enerji yüzeyleri ve/veya farmakolojik aktivatörler ve/veya inhibitörlerin varlığında bu titreşmenin kullanılması, farklı metabolik yolların katkısı ve sperm kapacitation sırasında sinyal basamakları ile metabolizma arasındaki kesişim hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Kütle spektrometresi uygulaması metabolizma çalışmalarında devrim yarattı. Hedeflenen metabolik profilleme ve metabolomik izleme, enerji metabolizmasındaki değişikliklerin hassas bir şekilde izlenmesine olanak sağlar. Ancak, metabolomik performans başarıyla kapsamlı eğitim gerektirir, deneyimli personel, ve pahalı, son derece hassas kütle spektrometreler her laboratuvar için hazır değil. Son yıllarda, bir hücre dışı akı analizörü kullanarak, Seahorse XFe96 gibi çeşitli hücre tiplerinde enerji metabolizmasında ki değişiklikleri ölçmek için bir vekil yöntemi olarak popüler büyüdü1,2,3,4,5.
Sperm son derece özel hareketli hücrelerdir; kimin görevi yumurta için baba genomu teslim etmektir. Boşaldıktan sonra erkek üreme sisteminden ayrılan spermler hala işlevsel olarak olgunlaşmamış durumdadır ve yumurtaların yeleklerine giremedikleri için yumurtayı dölleyemezler. Onlar kapacitation6,7olarak bilinen bir olgunlaşma sürecinde kadın üreme sistemi ile transit olarak Sperm döllenme yetkinliği elde . Cauda epididimisinden yeni boşalan sperm veya sperm, Ca2+içeren tanımlanmış kapasitasyon ortamlarında inkübasyon veya hücregeçirgen cAMP analogu (örn. dibutyryl-cAMP), kolesterol kabul verici (örneğin, sığır serum albumini, BSA) ve bir enerji kaynağı (örneğin, glikoz). Kapacitation sırasında, sperm asimetrik kamçı ritmi içine hareketlilik deseni değiştirmek, hiperaktivasyon denilen bir yüzme modu temsil 8,9, ve onlar akrozom reaksiyonu geçmesi için yetkili hale7, proteolitik enzimler yumurtaların vestments sindirmek serbest bırakılır. Bu süreçler enerji gerektirir ve somatik hücrelere benzer, sperm glikoliz yanı sıra mitokondriyal TCA döngüsü ve oksidatif fosfor (oksfos)10yoluyla ATP ve diğer yüksek enerjibileşikleri üretmek . Birden fazla çalışma glikoli gerekli ve sperm kapacitation desteklemek için yeterli olduğunu göstermek iken11,12,13,14, okfos katkısı daha az açıktır. Glikolisfiziksel TCA döngüsü ile birleştiğinde diğer hücre türlerinin aksine, sperm son derece bölümlere ayrılmıştır ve ayrı kamer bölmelerinde bu süreçleri korumak için düşünülmektedir: midpiece mitokondriyal makine konsantreleri, glikoli anahtar enzimleri ana parça 15 ile sınırlı gibi görünür ise16. Bu bölümleme, glikoliz tarafından ana parçada üretilen pirüvatın orta parçadaki mitokondriyal okfosu destekleyip desteklemeyeceği ve orta parçada oxphos tarafından üretilen ATP’nin anaparçanın 17,18,19’undistal kısımlarındaki enerji gereksinimlerini desteklemek için kamçının uzunluğu boyunca yeterince hızlı bir şekilde yayılıp dağıtılamayacağı konusunda devam eden bir tartışmayla sonuçlanır. Ayrıca sperm kapasitasyonunda oksfos rolü desteklenir. Sadece oxphos glikoliz daha enerjik olumlu, glikoliz daha 16 kat daha fazla ATP üreten, ancak orta hacim ve mitokondriyal içerik doğrudan eşleri için erkekler arasında rekabet daha büyük derece sergileyen memeli türlerinde üreme fitness ile ilişkilidir20. Bu soruların ele alınması, sperm kapanizasyonu sırasında glikoli ve okfosun göreceli katkılarını incelemek için yöntemler gerektirir.
Tourmente ve ark. 24-iyi ekstrasellüler akı analizörü uygulanan önemli ölçüde farklı sperm performans parametreleri ile yakından ilişkili fare türlerinin enerji metabolizmasını karşılaştırmak için21. Kapasitif olmayan spermin bazal ECAR ve OCR değerlerini raporlamak yerine, fare sperm kapaizasyonu sırasında ki enerji metabolizmasındaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için 96 kuyulu hücre dışı akı analizörü kullanarak metodlarını uyarlıyoruz. Oksijen (O2) ve proton (H+)(Şekil 1A)akını ölçerek, spermde glikoliz ve okfosların on iki farklı deneysel koşullarda kamçıyı yenerek gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayan bir yöntem geliştirdik. Glikoliz sırasında laktat için piruvat ın bozulması ve TCA-döngüsü ile CO2 üretimi nedeniyle, kapasite olmayan ve kapasitasyonlu sperm ekstrüzyonu H+ ispret media içine h+-hassas floropores ile algılanan bir sensör kartuşunun prob ucuna hareketsiz. Buna paralel olarak, oksidatif fosforilasyon ile O2 tüketimi aynı prob ucuna hareketsiz hale getirilen O2-duyarlı florofores ile tespit edilir(Şekil 1B). Serbest bırakılan H+ ve tüketilen O2 etkili tespiti bikarbonat veya fenol kırmızı olmadan düşük tamponlama kapasitesi ile değiştirilmiş bir sperm tampon gerektirir. Böylece, bikarbonat yokluğunda kapacitation indüklemek için, geniş menzilli PDE inhibitörü IBMX22ile birlikte enjekte bir hücre geçirgen cAMP analog kullanımını kabul etti. Üç ek bağımsız enjeksiyon portu farmakolojik aktivatörlerin ve/veya inhibitörlerin enjeksiyonuna izin verir, bu da deneysel manipülasyon nedeniyle hücresel solunum ve glikoliz hızındaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak algılanmasını kolaylaştırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bazı metabolik substratların veya kritik metabolik enzimlerin yokluğunda sperm kapaizatif kaybı başarılı döllenmeyi destekleyen önemli bir faktör olarak enerji metabolizmasını ortaya koymuştur. Hücre aktivasyonu sırasında bir metabolik geçiş diğer hücre tiplerinde köklü bir kavramdır, ancak, biz sadece nasıl sperm kapasiasyon sırasında artan enerji talebine metabolizmaadapte anlamaya başlıyor. Hücre dışı akı analizörü kullanarak, sperm kapasitasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fos…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Rockefeller Yüksek Throughput ve Spektroskopi Kaynak Merkezi’nde Dr Lavoisier Ramos-Espiritu destek kabul etmek istiyorum.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
Referenzen
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O’Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
