Использование внеклеточного анализатора flux для измерения изменений в гликолизе и окислительной фосфорилации во время емки спермы мыши

Применение масс-спектрометрии произвело революцию в изучении метаболизма. Целенаправленное метаболическое профилирование и метаболомическое отслеживание позволяют точно контролировать изменения в энергетическом метаболизме. Тем не менее, выполнение метаболомики успешно требует обширной подготовки, опытный персонал, и дорогие, высокочувствительные масс-спектрометры не легко доступны для каждой лаборатории. В последние годы, используя внеклеточный анализатор потока, таких как Seahorse XFe96 стал популярным в качестве суррогатного метода для измерения изменений в энергетическом метаболизме в различных типах клеток^1,2,3,4.

Сперма являются узкоспециализированными мотильные клетки; чья задача состоит в том, чтобы доставить отцовский геном к яйцеклетке. Сперматозоиды, покидающие мужской репродуктивный тракт после эякуляции, по-прежнему функционально незрелы и не могут оплодотворить яйцеклетки, потому что они не могут проникнуть в облачения яйцеклеток. Сперма приобретает компетенцию по оплодотворению, поскольку они проходят через женский репродуктивный тракт в процессе созревания, известном как конденсация^6,7. Свежеэякуляция сперма или сперма, расчлененные из кауда эпидидимис может быть конденсирован в пробирке путем инкубации в определенных емчечных носителях, содержащих Ca^{2 “}, бикарбонат (HCO₃^–) или клеточной проницаемой аналоге cAMP (например, dibutyryl-cAMP), принимая холестерин (например, буйный сывороточный альбомин, BSA) и источник энергии (например, глюкоза). Во время емкости, спермаизменить их шаблон подвижности в асимметричный флагельер бить, представляющий режим плавания называется гиперактивации^8,9, и они становятся компетентными пройти акросома реакции⁷, где протеолитических ферментов освобождены, которые переваривают облачения яйцеклеток. Эти процессы требуют энергии, и аналогичные соматические клетки, сперматозоиды генерировать АТФ и других соединений высокой энергии с помощью гликолиза, а также митохондриальный цикл TCA и окислительного фосфорилирования (оксифос)¹⁰. Хотя многочисленные исследования показывают, что гликолиз необходим и достаточно для поддержки спермы емчебой^11,12,13,14, вклад oxphos менее ясно. В отличие от других типов клеток, где гликолиз физически связан с циклом TCA, сперма сильно разобщена и, как полагают, поддерживает эти процессы в отдельных отсеках флагеллара: средний элемент концентратирует митохондриальную технику, в то время как ключевые ферменты гликолиза, как представляется, ограничены основной частью^15,16. Это разобщенности приводит к продолжающейся дискуссии о том, pyruvate производится в основной кусок гликолизом может поддерживать митохондриальный oxphos в середине, и является ли АТФ производства oxphos в середине будет в состоянии рассеять достаточно быстро по длине flagellum для поддержки энергетических потребностей в дистальных частей основной части^17,19. Существует также поддержка роли oxphos в емчеобразной сперме. Мало того, что oxphos более энергетически благоприятным, чем гликолиз, генерации 16 раз больше АТФ, чем гликолиз, но средний объем и митохондриальный содержание непосредственно коррелируют с репродуктивной пригодности у млекопитающих видов, которые демонстрируют большую степень конкуренции между мужчинами для товарищей²⁰. Для решения этих вопросов требуются методы изучения относительного вклада гликолиза и оксифоса во время конденсации спермы.

Tourmente et al. применили 24-хорошо внеклеточный анализатор потока, чтобы сравнить энергетический метаболизм тесно связанных видов мышей со значительно отличаемыми параметрами производительности спермы^21. Вместо того, чтобы сообщать о базальных значениях ECAR и OCR неконденционной спермы, здесь мы адаптируем их метод с помощью 96-хорошо внеклеточного анализатора потока потока для мониторинга изменений в энергетическом метаболизме во время емкостя спермы мыши в режиме реального времени. Мы разработали метод, который позволяет одновременно контролировать гликолиз и oxphos в режиме реального времени в сперме с избиением флагеллы в до двенадцати различных экспериментальных условиях путем измерения потока кислорода (O₂) и протонов (H⁾(Рисунок 1A). В связи с разбивкой пировата лактата во время гликолиза и производства CO₂ через Цикл TCA, неемные и емкие спермы экструдировать H^в анализ средств, которые обнаруживаются внеклеточного анализатора флюкса через H^–чувствительные флюорофоры обездвижены к кончику зонда датчика. Параллельно, O₂ потребление окислительного фосфорилирования обнаруживается через O₂чувствительных флюорофоров обездвижены к тому же наконечник зонда (Рисунок 1B). Эффективное обнаружение высвобожденных H^и потребляемых O₂ требует модифицированного буфера спермы с низкой буферной емкостью без бикарбоната или фенола красного цвета. Таким образом, чтобы вызвать емки при отсутствии бикарбоната, мы приняли использование клеточного аналога cAMP, введенного вместе с широкодиапазонным ингибитором PDE IBMX^22. Три дополнительных независимых порта инъекций позволяют впрыски фармакологических активаторов и/или ингибиторов, что облегчает обнаружение в режиме реального времени изменений в клеточном дыхании и скорости гликолиза в связи с экспериментальными манипуляциями.