使用细胞外通量分析仪测量小鼠精子发作期间糖解和氧化磷酸化的变化

质谱学的应用彻底改变了代谢学的研究。靶向代谢特征分析和代谢追踪可以精确监测能量代谢的变化。然而，成功实施代谢组学需要大量的培训、经验丰富的工作人员和昂贵、高度敏感的质谱仪，而每个实验室都不容易获得。近年来，使用细胞外通量分析仪，如海马XFe96，作为测量各种细胞类型^{1、2、3、4、5}能量代谢变化的替代方法，已经越来越流行。

精子是高度专业化的活细胞;其任务是把父系基因组传送给卵母细胞。射精后离开男性生殖道的精子在功能上仍然不成熟，不能受精卵母细胞，因为它们不能穿透卵母细胞的背心。精子在成熟过程中通过女性生殖道，称为”生育^{能力6，7″，}获得受精能力。从 cauda 表皮解剖的新鲜射精精子或精子可在体外孵育，在定义的电容培养基中孵育，其中含有 Ca^2+、碳酸氢盐 （HCO₃^–） 或细胞渗透 cAMP 模拟（例如，二丁基林-cAMP）、胆固醇接受器（例如，牛血清白蛋白、BSA）和能量源（如葡萄糖）。在细胞发育过程中，精子将运动模式改变为不对称的鞭状节拍，代表一种称为超活化^8、9的游泳模式，它们能够进行acrosome反应^7，其中蛋白水解酶被释放，消化卵母细胞的背心。这些过程需要能量，并且类似于体细胞，精子通过糖解以及线粒体TCA周期和氧化磷酸化（牛磷酸化^）10生成ATP和其他高能化合物。虽然多项研究表明糖解是必要的，足以支持精子的上限11，12，13，14，但牛磷的贡献则不那么明显。与其他细胞类型不同，糖解在物理上与TCA周期结合，精子高度分裂，被认为能将这些过程保持在单独的鞭节内：中间部分浓缩线粒体机械，而糖解的关键酶似乎仅限于主要部分^15，16。这种分割导致一场持续的争论，关于糖解在主要部分产生的丙酮酸盐是否可以支持线粒体牛磷在中间部分，以及ATP产生的牛磷在中间是否能够足够迅速地扩散沿旗杆的长度，以支持能量需求在主要部分17，18，19。也有支持牛磷在精子能力中的作用。牛磷不仅比糖解更有利，产生的ATP比糖解多16倍，而且中片体积和线粒体含量与哺乳动物物种的生殖适应性直接相关，而哺乳动物之间对配偶²⁰的竞争程度更大。解决这些问题需要检查糖解和牛磷在精子发作期间的相对贡献的方法。

Tourmente等人应用了24井细胞外通量分析仪，比较了与精子性能参数明显不同的小鼠物种的能量代谢^21。在这里，我们使用96井细胞外通量分析仪来实时监测小鼠精子吸收过程中能量代谢的变化，而不是报告非电容精子的基础ECAR和OCR值。我们开发了一种方法，通过测量氧的通量（O_2）和质子（H^+）（图1A），在多达12个不同的实验条件下，通过实时监测精子中的糖解和牛磷，在多达12个不同的实验条件下击败鞭状藻。由于在糖解过程中乳酸分解为乳酸，并通过TCA循环生产_CO2，非电容和容积的精子挤出H^–进入检测介质，由细胞外通量分析仪通过^H+敏感荧光管固定到传感器盒的探针尖端检测到。同时，通过氧化磷酸化检测_O2消耗，通过O_2-敏感荧光道固定到同一探针尖端（图1B）。有效检测释放的H⁺和消耗的_O2需要经过修饰的精子缓冲液，缓冲能力低，不含碳酸氢盐或苯酚红。因此，为了在没有碳酸氢盐的情况下诱导电容，我们采用了一种可渗透的cAMP模拟注射与广泛PDE抑制剂IBMX²²一起。三个额外的独立注射端口允许注射药理活化剂和/或抑制剂，这有助于实时检测细胞呼吸和糖解率因实验操作而发生的变化。