Visualisierung und Analyse von Pharyngeal Arch Arterien mittels ganzer Immunhistochemie und 3D-Rekonstruktion
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Analyse der Rachenbogenarterien 3, 4 und 6 von Mausembryonen mit ganzer Immunfluoreszenz, Gewebeklärung, konfokaler Mikroskopie und 3D-Rekonstruktion.
Abstract
Unsachgemäße Bildung oder Umgestaltung der Pharyngealbogenarterien (PAAs) 3, 4 und 6 tragen zu einigen der schwersten Formen der angeborenen Herzkrankheit bei. Um die Bildung von PAAs zu untersuchen, entwickelten wir ein Protokoll mit ganzer Immunfluoreszenz in Verbindung mit Benzylalkohol/Benzylbenzoat (BABB) Gewebeclearing und konfokaler Mikroskopie. Dies ermöglicht die Visualisierung des Pharyngealbogenendothel summieren bei feiner Zellauflösung sowie die 3D-Konnektivität der Vaskulatur. Mithilfe von Software haben wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Anzahl der Endothelzellen (ECs) in PAAs sowie der Anzahl der ECs innerhalb des Gefäßplexus, der die PAAs in den Pharyngealbögen 3, 4 und 6 umgibt, erstellt. Wenn sie auf den gesamten Embryo angewendet wird, bietet diese Methode eine umfassende Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Vaskulatur.
Introduction
Während der Mausembryogenese entstehen Pharyngealbogenarterien (PAAs) als symmetrische, bilaterale Arterienpaare, die das Herz mit der dorsalen Aortae1verbinden. Während sich der Embryo entwickelt, gehen das erste und zweite PAAs-Paar zurück, während die3.,4.und6. PAAs eine Reihe asymmetrischer Umbauereignisse durchlaufen, um die Aortenbogenarterien zu bilden2.
Die PAAs 3, 4 und 6 entwickeln sich über Vaskulogenese, die die de novo Bildung von Blutgefäßen3ist. Defekte bei der Bildung oder Umgestaltung dieser Bogenarterien führen zu verschiedenen angeborenen Herzfehlern, wie sie bei Patienten mit DiGeorge-Syndrom4,5beobachtet werden. Daher kann das Verständnis von Mechanismen, die die Entwicklung von PAAs regulieren, zu einem besseren Verständnis der angeborenen Herzkrankheit (CHD) Ätiologie führen.
Aktuelle Ansätze zur Visualisierung und Analyse der PAA-Entwicklung umfassen die Immunfluoreszenz von Gewebeabschnitten, Gefäßabgüsse, Indien-Tinteninjektion, hochauflösende episkopische Mikroskopie und/oder Ganzleitimmunhistochemie1,4,5,6,7. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, das Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und 3D-Bildwiedergabe kombiniert, um volumetrische Daten, vaskuläre Konnektivität und Zellidentität zu sammeln, zu analysieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Abschottung und Quantifizierung der Anzahl der ECs in jedem Rachenbogen als Mittel zur Untersuchung der Bildung des Pharyngealbogen-Gefäßplexus und dessen Umgestaltung in die PAAs. Während dieses Protokoll für die Analyse der PAA-Entwicklung entwickelt wurde, kann es verwendet werden, um andere sich entwickelnde Gefäßnetzwerke zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Möglichkeit, das Endothel in Mausembryonen in 3D zu visualisieren, hat neue Einblicke in ihre Entwicklung 3gegeben. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine hochauflösende 3D-Bildgebung von Embryonen, die Visualisierung der vaskulären Konnektivität und quantitative Analysen der PAA-Bildung ermöglicht. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu sehen, wie genetische Veränderungen oder Umweltbeleidigungen die ENTWICKLUNG der PAA beeinflussen. Das hier beschriebene Verfahren verwende…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Brianna Alexander, Caolan O’Donnell und Michael Warkala für die sorgfältige Lektüre und Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung durch das National Heart, Lung and Blood Institute des NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 bis SA unterstützt; AJR wird unterstützt von NHLBI HL103920-08S1 und dem National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Training Grant T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
Referenzen
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