使用全载免疫作用化学和三维重建对咽弓动脉的可视化与分析
Summary
在这里，我们描述了一种协议，使用全孔免疫荧光、组织清除、共聚焦显微镜和3D重建来可视化和分析小鼠胚胎的咽弓动脉3、4和6。
Abstract
咽弓动脉（PAA）3、4和6的不当形成或重塑导致一些最严重的先天性心脏病。为了研究PAA的形成，我们开发了一种方案，使用全支式免疫荧光结合苯基醇/苯甲酸苯甲酸酯（BABB）组织清除和共聚焦显微镜。这允许以精细的细胞分辨率可视化咽喉拱内体，以及血管的 3D 连接。使用软件，我们建立了一个协议，以量化PAA中的内皮细胞 （EC） 数量，以及咽喉拱门 3、4 和 6 内围绕 PAA 的血管丛中的 E 数。该方法应用于整个胚胎时，对胚胎血管进行综合的可视化和定量分析。
Introduction
在小鼠胚胎形成期间，咽喉弓动脉（PAAs）出现为对称的两侧动脉对，将心脏与背动脉1连接起来。随着胚胎的发展，第一和第二对PAA回归，而第3、4和6PAA经历一系列不对称的重塑事件，形成主动脉2。
PAAs 3、4 和 6 通过血管生成而发展，这是血管的脱层3。这些弓动脉形成或改造的缺陷导致各种先天性心脏缺陷，如在DiGeorge综合征44，55患者看到。因此，理解调节PAA发展的机制可以导致对先天性心脏病（CHD）病因的更好理解。
目前用于可视化和分析PAA发展的方法包括组织部分的免疫荧光、血管铸件、印度墨水注射、高分辨率的异见显微镜和/或全卡免疫组织化学11、4、5、6、7。4,5,6,7在这里，我们描述了一种结合全载式免疫荧光、共聚焦显微镜和3D图像渲染的协议，以便收集、分析和量化体积数据、血管连接性和细胞识别。此外，我们详细介绍了一种将每个咽喉拱中的ECs数量分割和量化的方法，作为研究咽喉弓血管丛的形成及其重新改造到PAA的方法。虽然该协议是专为分析PAA发展而设计的，但它可用于分析其他正在发育的血管网络。
Protocol
Representative Results
Discussion
在3D小鼠胚胎中可视化内皮的能力为小鼠胚胎的发展提供了新的见解。在这里，我们提出了一个协议，允许对胚胎进行高分辨率的3D成像，血管连接的可视化，以及PAA形成的定量分析。该协议可用于查看基因改变或环境侮辱如何影响 PAA 发展。此处报告的程序使用针对VEGFR2和ERG的抗体来可视化PAA形成和量化EC编号;然而，额外的抗体可用于可视化和分析弓动脉发展的其他方面，如神?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢布赖恩娜·亚历山大、曹兰·奥唐纳和迈克尔·沃卡拉仔细阅读和编辑这份手稿。这项工作得到了NIH R01 HL103920、R01 HL134935、R21 OD025323-01至SA国家心脏、肺血研究所的资助;AJR得到NHLBI HL103920-08S1和国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤病训练补助金T32052283-11的支持。
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
Referenzen
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Entwicklungsbiologie. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
