이 프로토콜은 번역 바이오마커 분석에 사용될 수 있는 임상 시험 현장에서 고품질 PBMC 및 플라즈마 바이오샘플의 임상 구현 가능한 제제를 상세히 설명합니다.
말초 혈액에 있는 biomarkers의 분석은 처리의 효력을 평가하기 위하여 기계장치의 증명을 확립하기 위하여 임상 시험에서 점점 더 중요해지고 있습니다, 및 치료의 복용량 및 일정 설정을 안내하는 것을 돕습니다. 단일 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포는 단백질 마커를 분석하고 정량화하기 위해 분리 및 처리 될 수 있으며, 혈장 샘플은 순환 종양 DNA, 사이토카인 및 혈장 메타볼로믹스의 분석에 사용될 수 있다. 치료로부터의 경도 샘플은 주어진 단백질 마커의 진화, 환자의 돌연변이 상태 및 면역 학적 풍경에 대한 정보를 제공한다. 이것은 말초 혈액의 처리가 임상 현장에서 효과적으로 수행되고 견본이 침대 옆에서 벤치로 제대로 보존되는 경우에 달성될 수 있습니다. 여기서는 다중 센터 임상 시험에서 PBMC 펠릿 및 플라즈마 샘플을 얻기 위한 임상 현장에서 구현할 수 있는 최적화된 범용 프로토콜을 제시하여 병원 실험실의 임상 전문가가 기술 적 전문 지식 수준에 관계없이 고품질 샘플을 성공적으로 제공할 수 있도록 합니다. 보다 구체적인 다운스트림 분석 방법에 최적화된 대체 프로토콜 변형도 표시됩니다. 우리는 DDR 약물 및 / 또는 방사선 요법이 실행된 종양학 설정에서 접근법의 적합성을 입증하기 위해 X 선 조사 혈액에 DNA 손상 반응 (DDR)에 대한 단백질 바이오 마커를 연구하기위한이 프로토콜을 적용하고 기계적 가설 테스트가 필요한 전임상 단계에서도.
신약 개발은 충족되지 않은 의료 적 요구와 보다 표적화된 맞춤형 의학을 다루는 새로운 치료법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 다중 약물 기전은 키나아제1,프로테아제2,또는 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제(PARP) 억제제3,단백질 분해제4,치료항체5,항체-공주약물(ADC)6,그 외 로의 효소 억제를 포함하는 활성 조사를 받고 있다. 종양학에서 더 나은 치료를 얻기 위한 노력의 예는 암세포가1,7로확산되는 신호 캐스케이드를 중지하는 것을 목표로 키나아제 억제제의 사용이다. 이러한 키나아제에 특이적인 기판 인산화의 수준을 측정하는 것은 이들 억제제의 작용 메커니즘을 정량화하는 최고의 약력학적바이오마커이다 8. 다른 약물은 주어진 단백질의 발현을 조절할 수 있으며, 이 경우 치료 과정 전반에 걸쳐 표적 단백질의 농도 변화를 세로로 정량화할 수 있는 것이 가장 중요하다. 따라서 약물 또는 병리학의 특성과는 별개로 약물 노출과 표적 변조 사이의 약동학(PK)/약역학(PD) 관계를 확립하기 위한 바이오마커의 평가는 초기 임상 개발에서 모범 사례이며 안전하고 용대한 약리활성 용량/일정9의결정을 가능하게 한다.
종양학 임상 개발에 있는 동안, 생검에 있는 biomarker 분석은 약의 기계장치의 증명을 확립하기 위하여 제일 설정일지도 모르지만, 예심에 있는 유효한 생검의 수는 일반적으로 아주 제한된10,11입니다. 대안적으로, 말초 혈액 샘플은 최소한의 침습적 절차를 수반하고, 종로 분석을 용이하게 하기 쉽고, 생검보다 저렴하며, 치료의 결과를 실시간으로 모니터링하기 위한 방대한 정보를 제공하기 때문에 임상 시험에 매우 중요합니다. 말초 혈액에서 PD 바이오마커를 평가하는 추가적인 이점은 PK/PD 정량적 관계 및 후속 PK/PD 모델링12,13을결정하는 정확한 기능을 허용하는 PK를 정량화하기 위해 바이오샘플을 사용하는 능력이다. 전혈의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 발현 수준 또는 번역 후 수정의 변화를 경험하는 단백질 마커를 연구하기 위해 격리 될 수 있습니다. 또한, PBMC는 RNA 절연을 통해 항체 의존성 세포 세포 독성(ADCC) 16 및 후성유전학 적 분석을 평가하는 것과 같은 면역페노티핑 목적14, 15,면역 기능 성 분석에 사용될 수 있다. 마찬가지로, 전혈에서 혈장은 환자의 면역 반응을 특성화하고, 대사 연구를 수행하고, 또한 치료약제로부터 선택하에 질병의 클론 진화를 모니터링하기 위한 종양 DNA(ctDNA)를 분리 및 서열화하기 위해 사이토카인을 정량화하는 데 사용될 수 있으며,치료저항성 17,18,19세대의 후속 치료제 개발을 가능하게 한다. 마지막으로, 말초 혈액으로부터 순환 종양 세포(CTC)의 분리는 세로 열거, DNA/RNA 염기서열분석 및 단백질-바이오마커분석(21)에의한 질병 진행의 평가를 가능하게 한다. 이러한 격리는 본 명세서에서기재된 프로토콜과 호환되지만, 많은 암 유형 및 초기 단계에서 CTC의 낮은 풍부는 CTC분해(23)를최소화하기 에 더 적합한 전문 튜브의 사용을 만든다.
최근 몇 년 동안, 액체 생검의 사용은 임상 시험및 PBMC 수집에서 얻은 정보를 개선하여 일부 유형의 혈액학적 악성 종양에 대한 종양 세포에서 직접 표적 참여 및 메커니즘의 증거를 모니터링하거나,24,25,26의PD 대리로서 PBMC 자체에 포함되었다. 고품질 시료의 제조는 주어진 병리학에 대한 가장 안전하고 가장 효과적인 치료를 결정하는 데 긍정적 으로 영향을 미치지만, 우리의 경험에서, 다른 임상 사이트에서 얻은 PBMC 준비의 품질은 다운스트림 분석의 목적에 맞지 않는 샘플의 결과로 품질에 넓은 가변성을 겪고있다. 이것은 그 연구 결과에서 수집될 수 있는 PD 데이터의 양에 영향을 미쳤습니다.
여기서 우리는 임상 환경에서 단일 혈액 무승부에서 PBMC와 플라즈마 샘플을 효율적으로 분리하는 방법을 보여주는 프로토콜을 쉽게 따르기 쉬운 것을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 원심분리 문제, 처리 지연 및 극저온으로의 샘플 전송과 같은 임상 사이트에서 보고한 프로토콜 실행의 어려움을 실제 경험이 강조한 수정을 통합하는 단일 핵 세포 준비 튜브 제조업체의 지침을 기반으로 합니다. 혈액(27)으로부터용액을 분리하는 장벽 유무에 관계없이 다당류 용액을 이용한 밀도 그라데이션 분리를 기반으로 한 단일핵 세포 제제 튜브의 사용에 대한 대체 상업적 사용 방법이 있다. 관련 임상 사이트가 이미 이러한 대체 방법론에서 경험이 부족한 경우, 이 프로토콜은 이 프로토콜을 이와 함께 받아들일 수 있게 대체할 수 있다. 이러한 경우, 두 가지 요인을 고려할 수 있다: 일부 대체 방법은 인간 1차 생물학적 물질의 추가 전달이 약간 증가한 안전 위험을 초래할 수 있는 별도의 준비 튜브로 전혈의 전혈을 전달해야 하며, 다당류 용액으로부터 혈액을 분리하는 장벽이 없는 방법의 성공은 항상 정제되지 않은 실험실 의 정제 된 수준의 개발을 필요로 하는 밀도 그라데이션 매체에 혈액 샘플을 겹쳐 올리는 것과 같은 중요한 단계에 의존한다. 위의 점에도 불구하고, 전반적인 생존력과 세포 회수는 이러한기술(15,28)과비교된다. 방법론의 선택은, 그러므로, 이전 기술 경험에 다소 의존적이지만, 우리의 손에, 단핵 세포 준비 튜브는 광범위한 임상 맥락에서 성공적으로 사용될 수 있고, 그렇지 않으면, 추천입니다.
이 프로토콜의 한 종점은 용액으로의 추가 처리를 위한 PBMC 펠릿을 생성하는 것이지만, PBMC 수집의 다른 최종 응용 은 핵산의 격리, 또는 면역 히스토케미크(IHC) 방법에 적합한 PBMC 얼룩 또는 PBMC 블록을 생성하는 것과 같은 구현될 수 있었다. 중요한 것은, 환자로부터 채취한 각 생체샘플은 적어도 어느 정도 침습적인 절차를 나타내기 때문에, 이 프로토콜은 사이토카인 분석, 메타볼로믹 연구 또는 ctDNA 시퀀싱에 사용될 수 있는 플라즈마를 격리하여 각 시료로부터 유용한 물질을 극대화한다.
종양학 예심에 있는 말초 바이오마커의 분석은 PBMC 용재의 많은 응용의 한개입니다. 한 가지 예는 화학요법, 방사선 요법 또는 인산다이들리노시톨-3 키나제 관련 키나아제(PIKKs)7 및 PARPs3,13과같은 DDR에 관여하는 효소의 억제제의 사용과 같은 치료에서 DNA 손상 반응(DDR)의 평가이다. 이러한 치료의 목적은 암세포와 같은 손상된 DDR 메커니즘 및 세포 주기 검사점을 가진 세포에서 높은 독성을 생성하는 증식 세포에서 DNA 손상을 증가시키는 것입니다. 여기서 우리는 엑스레이를 실시하는 말초 혈액에 있는 DDR biomarkers의 연구 결과와 예를 제시합니다.
임상 시험 현장에서 견고하고 재현적으로 제조할 수 있는 PBMC및 플라즈마의 고품질 제제는 임상 시험 주변 예측 및 약동적인 번역 바이오마커 종점을 알리는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 임상 시험 환경에서 실행 오류에 취약한 일반적으로 문제가되는 단계를 해결하는 짧고 명확한 프로토콜을 제공했습니다. 그러나, 프로토콜은 임상 현장이나 다운스트림 분석유형의 시간 제약조건과 같은 특정 요구 사항을 충족하도록 더욱 최적화될 수 있다(보충 파일참조).
이를 위해 단핵세포 제제튜브를 이용하여 PBMC와 플라즈마를 전혈에서 분리하여 다양한 다운스트림 분석에 적합한 냉동 PBMC 펠릿과 냉동 플라즈마를 생산하는 방법을 보여주었습니다. 우리는 단계 2.5에서 PBMC 층의 원심 분리 및 식별을 포함하는 특히 중요한 프로토콜 단계와 3.3 및 3.6 단계에서 PBMC 펠릿에주의를 기울였습니다. 역사적으로, 임상 사이트가 종종 잘못된 경우 올바른 단위 (RCF 또는 X g 값을 RPM 값으로 혼동)로 원심분리기를 설정하는 것입니다, 혈액 샘플의 처리를 지연, 온도 및 냉동 된 세포 펠릿 위의 PBS의 대량의 존재. 대부분의 원심분리기 로터는 RPM 설정으로 x g 값을 잘못 입력하면 PBMC 층이 제대로 정의되지 않거나 결석한 PBMC 층과 함께 상당한 저심분리가 발생하고 비효율적인 세포 펠릿화로 인해 세척 단계에서 의도하지 않은 PBMC가 폐기될 수 있습니다. 그러나, 환자가 백혈병을 개발한 경우 적절한 원심분리 설정 및 로터 어댑터를 사용했음에도 불구하고 PBMC 층이 보이지 않을 가능성이 있다. 이 조건은 화학요법 또는 방사선 치료 때문에 종양학 예심에 등록된 환자에 영향을 미칠 수 있고 고려되어야 합니다. 프로토콜에서 명확히 된 또 다른 중요한 점은 혈액 무승부에서 1-2 시간 이내에 샘플을 처리하여 용혈이 프로토콜에 부정적인 영향을 미칠 가능성을 감소시켜야한다는 것입니다. 더욱이, 혈액 드로우의 첫 번째 시간 동안 시료를 처리하는 것을 목표로 하는 것은 전 생체 내 가변성을 감소시키며, 이는 약동학 판독및 혈액 보존 또는 활성 신호 경로에 의해 영향을 받는 바이오마커에 큰 영향을 미칠 수 있는 4도에도시된 경우와 같은 것이다. 세포가 냉동 보존 될 것 인 경우 샘플 처리의 지연은 세포 생존능력에 해로운 영향을 미칠 수있습니다(34). 수율과 적혈구 오염에 영향을 줄 수 있는 또 다른 요인은 실온(18-25°C)에서 보관해야 하는 저장 및 원심분리 온도입니다. 낮은 온도는 밀도 그라데이션 매체의 밀도를 증가, 이러한 세포뿐만 아니라 집계하지 않기 때문에 적혈구와 과립 세포 오염의 높은 정도를 초래. 한편, 더 높은 온도는 응집된 적혈구 사이에 갇힌 PBMC로 이어지므로준비(15,27,28)의수율을 감소시킵니다. 그리고 마지막으로, 이러한 PBMC 제제의 하류 처리에서 얻은 단백질 용액의 농도에 부정적인 영향을 미치기 때문에 50-100 μL 이하의 액체가 극저온에서 세포 펠릿에 존재하지 않는 것이 중요합니다. 액체의 과잉은 바이오 마커 분석에 적합하지 않은 매우 낮은 단백질 농도로 용액으로 이어지는 샘플을 과도하게 희석합니다. 또한, 번역 후 수정의 보존이 손상되고, 용해의 효율성도 크게 감소될 것이다.
단핵 세포 준비 튜브는 우리의 경험에서 우수한 재현성을 가진 임상 시험을 위한 단 하나 혈액 무승부에서 PBMC와 플라즈마둘 다 격리하는 가장 간단한 방법을 제공하기 때문에 선택되었습니다. 혈액 처리는 고도로 훈련된 연산자가 필요하지 않으며, 단일 튜브의 사용은 혈액과 다른 튜브로의 이송을 희석할 필요성을 제거하여 위험 위험을 낮춥니까; 브레이크가 있는 원심분리 단계를 수행하기 때문에 프로토콜을 단축; 모든 시약은 튜브에 있어 가변성을 줄입니다. 우리의 경험에서, 이러한 혜택은 밀도 그라데이션 분리 매체27,28 (60 단위 당 £ 410 의 사용을 포함하는 다른 고전적인 방법에 비해 이러한 튜브의 높은 비용을 능가66 50-mL 준비에 대한 림프 준비 매체는 £ 215입니다). 이들은 두 가지 유형의 항응고제, 헤파린 및 구연산염으로 제공되며, 둘 다 격리된 PBMC35의기능을 유지하는 데 필적하며, 따라서 한 항응고제의 선택은 다운스트림 바이오마커 연구에서 헤파린 또는 구연산의 가능한 영향에 기초하게 될 것이다. EDTA 튜브가 헤파린 또는구연산13에비해 PBMC 격리 율이 가장 높은 것으로 나타났지만, 1관 전용 조작 의 사용 편의성의 이점은 이러한 고려 사항의 균형을 이뤄낸다. 사이토카인이 분석될 경우 항응고제는 플라즈마에서 검출된 수준의 효과를 가질 수 있으므로 임상시험(36)을선택하기 전에 두 항응고제를 모두 테스트해야 한다. 플라즈마가 메타볼로믹스 연구에 사용될 경우, 헤파린을 항응고제로 사용하는 것이 바람직할것이다(37). 따라서 최종 사용자 또는 임상 시험 번역 과학자에게 남은 유일한 점은 구연산또는 헤파린이 비용을 평가한 후에 그들의 목적을 위해 더 적합할지 여부입니다.
세포 준비 튜브를 사용하는 이점은 그들이 제기하는 한계에 비해 많은 반면 (항응고제의 제한된 범위의 높은 비용 및 가용성), 임상 시험에서 PD 바이오 마커를 얻기 위해 PBMC 또는 플라즈마의 사용의 주요 제한, 특히 종양학에서, 격리 방법과 관련이있을 수 있습니다. 종양이 말초 혈액에서 직접 샘플링되는 혈액학적 암을 제외하고, 다른 암 징후 플라즈마 및 PBMC는 반드시 1 차 종양을 모방하지 않는 대리 조직입니다. 말초 조직은 1 차종양과 게놈 및 후성유전체를 공유하지 않을 수 있으므로, 특정 종양 돌연변이에 의존하는 바이오마커의 말초 분석은 주로 ctDNA 분석(혈장에서) 또는 CTC(PBMC 층의 후속 정렬에 의하여)로 제한됩니다. 또한, 종양 증식을 구동하거나 기여하는 캐스케이드를 신호하는 것은 말초 혈액에서 활성화되지 않을 수 있다. 이러한 과제는 혈액8을 대상으로 바이오마커 발견 접근법을 적용하여 대체 바이오마커를 식별하거나 전 생체 내 치료를 플라즈마38 및 PBMC제제(26)의격리에 결합함으로써 극복할 수 있다.
현재 프로토콜에서 냉동 PBMC 펠릿은 서양 블로팅 또는 ELISA 기술에 의해 평가될 수 있는 단백질 리세이를 제공하기 위해 임상 부위에서 쉽게 처리될 수 있다. IHC 메서드를 활성화 하기 위해 PBMC를 사용 하 여 다른 방법 도 제시 되었습니다(보충 파일). 또한 면역 세포 모니터링을 위한 PBMC(보충 파일참조)의 가능성을 상세히 설명했으며, 종양학분야의 관련 응용 분야인 면역 검사점 억제제 및 ADC가 임상 시험에서 점점 더 많이 테스트되고 있습니다. ADCC(16) 및 면역페노티핑과 같은 면역 기능의 평가는 단핵 세포 준비튜브(15)로부터분리된 냉동 보존 PBMC와 호환되는 응용 응용이다. 특정 표면 및 내부 마커의 하향 조절을 촉진하고 특정 세포 기능을 손상시킬 수 있으므로 냉동 보존에 주의해야 하지만, PBMC 냉동 보존은 여러 임상 부위로부터 시료를 처리할 때 시간 제약으로 인해 이러한 실험을 수행할 수 있는 유일한 실현 가능한방법이며,이러한 해로운 효과는 좋은 해빙 방법 및39의양해한 방법으로 크게 극복할 수 있다.
결론적으로, 여기에 제공된 프로토콜은 말초 혈액에서 의 번역 종점이 글로벌 임상 시험에서 강력하게 활성화 될 수 있도록 공통 장비 및 재료와 모든 임상 기관에서 PBMC및 플라즈마 샘플의 신뢰할 수있는 준비를 할 수 있습니다.
마지막으로, 우리는 PBMC lysates의 분석이 임상 발달을 형성하는 데 사용할 수있는 주요 DDR 요인의 용량 의존 적 번역 후 수정을 보여줌으로써 DNA 손상 제에 대한 반응을 기계적으로 알릴 수있는 방법을 보여줍니다. 미래 지향적, 서양 블로팅(예를 들어, 질량분석법 40)보다양적및 덜 입력 물질(예: 모세관 서부 블로팅 및 ELISA)을 필요로 하는 방법의 구현은 이러한 전임상 결과를 PBMC 환자 샘플의 보다 강력하고 체계적인 평가로 이동하는 데 도움이 될 것이다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 프로토콜에 대한 그들의 의견에 대한 아스트라 제네카 종양학 연구 및 조기 개발에서 번역 의학의 모든 구성원에게 감사드립니다, 특히 헤들리 카, Tammie Yeh와 네이선 스탠드니퍼는 ctDNA 분석을위한 플라즈마 준비에 대한 조언을, PBMC 절연에, PBMC 냉동 보존 및 면역 면역 페노티핑, 각각.
1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |