小鼠巨噬体化学术的延时成像

这些协议遵循我们当地研究伦理委员会的准则以及动物护理准则。 注：图 1显示了化学化测定的工作流。 1. 预填充化学幻灯片 使用经过修改的 RPMI 1640 HEPES 介质预填充一个或两个化学型滑轨的 1 mm 宽和 2 mm 长连接通道，包括不含碳酸氢盐的 RPMI 1640 介质，含有 20 mM 4-（2-羟基苯甲酸）-1-管氨酸硫酸 （HEPES），10%热灭活胎儿牛血清（FBS），以及抗生素，如青霉素（100 U/mL）和链霉素（100微克/米），通过稀释100x青霉素/链霉素制备， 和 1 μg/mL 脂多糖（来自大肠杆菌）和一个收费样受体 4 配体使用激活单元格。 将化学滑片（图2A）放入圆形（直径为10厘米）的细胞培养盘中，既预热至37°C，又将菜放在加热（37°C）铝块上。将插头插入端口 1 和 4（图 2B）。注：铝块保持在37°C，并放置在层流罩内，可用于制备化学室。理想情况下，加热块应为各种管（如 50 mL 管和 2 mL 微离心管）提供平坦的工作区域和井。 使用带有倾斜尖端的 10×200 μL 移液器尖端，将 15 μL 的改进型 RPMI 1640 HEPES 介质沉积到灌装口 3（图 2B）。接下来，当体积仍设置为 15 μL，并且 （2~20 μL 体积） 移液器的控制按钮按下时，将移液器尖端插入端口 2，以中等快的速度吸进 15 μL（图 2B）。这将预填充 1 mm x 2 mm 连接通道（观察区域）以及两个侧翼供应通道（分别位于中央观察区域和端口 2 和 3 之间）。用盖盖住填充端口 2 和 3。 预灌装后，将化学滑轨放在 37 °C 下干燥且不含 CO2的封闭湿度室的机架上。注：使用正确的移液器尖端填充化学滑轨非常重要。倾斜移液器将楔子插入灌装口的顶部，而常用的尖移液器尖端可以更深地插入灌装口，并可能大大提高对流体流动的阻力。 2. 小鼠居民围锥形巨噬细胞的隔离 使用高浓度挥发性麻醉异氟兰（空气中的>5%）或二氧化碳25，然后宫颈错位，牺牲一只3⁄4个月大的小鼠。啮齿动物右反射的丧失与人类意识的丧失有关26。用水中用80%乙醇清洁小鼠腹部，然后用带有钝尖的手术剪刀进行1⁄2厘米的中线皮肤切口。剥回皮肤，露出底层的腹壁。 将 24 G 塑料导管插入心内腔。使用 5 mL 塑料注射器，使用 2 x 4.5 mL 冰冷 Hank 的缓冲盐溶液 （HBSS） 对腔进行清除，无需 Ca2+和 Mg2+。将大约 0.5 mL 的剩余 HBSS 留在注射器中，以便无意中吸到导管尖端的组织可以排出。 将洗网介质（通常共 8-8.5 mL）转移到 14 mL 聚丙烯圆形底管中。在室温下，将管子在 300 x g下离心 6.5 分钟。注：圆形底部管允许上清液完全去结，并减少细胞结块。 在经过修改的RPMI 1640 HEPES介质的200μL中丢弃上清液细胞并重新悬浮圆锥细胞（通常每只小鼠+4 x 106细胞）。稀释细胞悬浮液的样本1：20，并使用计数装置，如Neubauer改进的计数室，对细胞进行计数。接下来，使用加热铝块将细胞悬浮液稀释至最终浓度为10 x 106细胞/mL，并将细胞保持在圆形底部 2 mL 聚丙烯微离心管中 37°C。 3. 将内锥细胞播种到化学片幻灯片中 移液细胞悬浮液上下5倍后，移液器体积设置为100 μL（或悬架体积的一半），以减少结块，轻轻将10μL的细胞悬浮液沉积到化学室的端口3中（图2C）。将移液器尖端放入端口 2 中，然后缓慢地将电池悬架绘制到连接通道中（图 2C）。一旦引入电池悬浮液，拆下端口 1 和 4 处的插头，这将有助于阻止电池悬浮液的流动。在所有四个填充端口上放置盖。 对所有化学室重复步骤 3.1。使用小型倒置显微镜和 10 倍相位对比客观透镜，检查化学片幻灯片中是否有不需要的气泡。 将用圆锥细胞种子的化学滑轨置于37°C的湿度室中，温度为2~3小时。 4. 填充储层并添加化学吸引物 使用倒置显微镜检查观察区域（连接两个 40 μL 储液罐的通道）。注：在此阶段，细胞密度将高于填充储液罐后，因为弱粘细胞，主要是CD19+细胞（B1细胞），将在填充过程中冲出观察区域（图2C+E）。 将插头插入填充端口 1 和 2（图 2D）。确保填充端口 3 顶部充满中度和无气泡。如果需要，使用无菌的 27 G 注射器针去除不需要的气泡。 使用 10×100 μL 体积的机械移液器，吸气 ±60 μL 的改性 RPMI 1640 HEPES 介质，并将移液器尖端放入灌装口 3。使用移液器的体积设置环缓慢而稳定地将介质注入储液罐中，使介质在 1⁄2 分钟后到达填充端口 4 的顶部（图 2D）。 填充第二个储液罐。将插头从端口 1 中移动，然后缓慢地将其插入端口 3（图 2D）。接下来，吸气 ±50 μL 的改进型 RPMI 1640 HEPES 介质，并将移液器尖端放入灌装口 4。使用 10×100 μL 体积移液器的体积设置环缓慢而稳定地将介质注入第二个储液罐中，使介质在 1⁄2 分钟后到达填充端口 1 的顶部（图 2D）。 将495μL的改性RPMI 1640 HEPES介质放入（圆形底部）2 mL微离心管中，加入5μL的专利蓝V（库存溶液：磷酸盐缓冲盐水[PBS]中的10mg/mL），这种蓝色染料用作浓度梯度形成的视觉指标。通过短暂的涡旋混合。加入5.4 μL的重组小鼠补补C5a（库存溶液：50 μg/mL在PBS与0.1%牛血清白蛋白）和混合通过短暂的涡旋。 沉积 15 μL 的蓝色，补充含 C5a 的介质到填充端口 1（图 3A），在确保端口顶部的浅凹陷是中等无中（否则下降可能会溢出）。 将 10×200 μL 移液器尖端插入灌装口 4，缓慢而稳定地旋转 10×100 μL 体积移液器的体积设置环，以绘制蓝色滴，将含有 C5a 的介质补充到相反储液罐中（图 3B）。空气将开始进入加注端口 1 的短垂直列。将空气拉入，直到液-空气接口位于垂直柱的中间，然后缓慢地将插头插入端口。 用另一只手轻轻地从端口 4 上提起移液器，以确保滑道保持固定到位。最后，缓慢插入端口4（图3B）。 在倒置显微镜上检查化学滑轨。注：观察区域中的剩余粘附细胞应以巨噬细胞为主。这可以通过荧光标记的抗F4/80抗体（F4/80是小鼠巨噬细胞的特定标记）进行确认。B细胞可以使用荧光标记的抗CD19抗体和F4/80-/CD19-细胞可以使用蓝色荧光核酸染色检测细胞（图4）。 5. 按延时、相位对比显微镜成像巨噬体迁移 将化学滑道滑道放在装有舞台培养箱的倒置显微镜的舞台上。将温度保持在 37 °C。 使用 10 倍相位对比度目标透镜成像 1 mm x 2 mm 观察区域，并专注于巨噬细胞拉梅利波迪亚：薄片状膜突起。以每 2 分钟 1 帧的速度捕获 14 小时的图像。 6. 延时图像分析 使用自动图像分析软件或 Fabrice P. Cordelrees 为 ImageJ 制作的手动跟踪插件分析延时相位对比图像。注：自动跟踪程序可用于分析通过延时、相位对比或荧光显微镜成像的细胞。例如，Cordelrees等人27生产的基于Java的软件iTrack4U可用于使用延时、相位对比或荧光图像作为输入进行自动细胞跟踪和分析。手动跟踪更耗时，但 ImageJ 插件手动跟踪生成的轨道可以直接导入，并通过 ImageJ 插件 Chemotaxis 和迁移工具28、,29自动分析。