إثراء الأنسجة الثديية وأوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول

الكوليسترول، والدهون الخلوية الرئيسية، يلعب العديد من الأدوار الوظيفية والهيكلية الحرجة^{1،,2،,3،,4،,5،,6،,7،,8،,9}. من تنظيم الخصائص الفيزيائية لغشاء البلازما إلى ضمان بقاء الخلية والنمو والانتشار ، والعمل كجزيء إشارة وسلائف في عدد كبير من المسارات الكيميائية الحيوية ، الكوليسترول هو مكون ضروري لوظيفة الخلية والجهاز الطبيعي. ونتيجة لذلك، يؤدي نقص الكوليسترول إلى تشوهات جسدية حادة ومجموعة متنوعة من الاضطرابات. من ناحية أخرى ، حتى زيادة صغيرة في الكوليسترول فوق المستويات الفسيولوجية (2-3x) هي سامة للخلايا^1،2،10 وقد ارتبطت بتطور الاضطرابات ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية^11،12،13 والأمراض العصبية التنكسية^{14،15،16،17.} وهكذا، لاستجواب الوظائف الحرجة للكولسترول وتحديد تأثير التغيرات في مستويات الكوليسترول، تم تطوير النهج المختلفة التي تغير محتوى الكوليسترول في الأنسجة والخلايا والبويضات Xenopus.

تغير مستويات الكوليسترول في أنسجة الثدييات والخلايا
يمكن تسخير العديد من النهج لتقليل مستويات الكوليسترول في الأنسجة والخلايا^18. نهج واحد ينطوي على تعرضهم للستاتين الذائبة في مصل نقص البروتين الدهني لمنع اختزال HMG-CoA, الذي يتحكم في معدل تخليق الكوليسترول^19,,20. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوية المخفضة للكوليسترول تمنع أيضًا تشكيل منتجات غير ستيرول على طول مسار الميفالونات. لذلك ، يتم إضافة كمية صغيرة من الميفالونات للسماح بتشكيل هذه المنتجات²¹ وتعزيز خصوصية هذا النهج. نهج آخر لخفض مستويات الكوليسترول ينطوي على استخدام α-cyclodextrins. هذه مونومرات glucopyranose تمتلك تجويف الهيدروفوبيا الداخلية مع القطر الذي يطابق حجم الستيرول²²، مما يسهل استخراج الكوليسترول من الخلايا ، وبالتالي استنزافها من محتواها الأصلي الكوليسترول^23. مثال على ذلك هو 2-هيدروكسي بروبيل-α-cyclodextrin (HPαCD)، وهو دواء ما قبل السريرية التي يجري اختبارها حاليا لعلاج مرض نيمان بيك من النوع C، وهو اضطراب التمثيل الغذائي القاتل الموروثة وراثيا تتميز تخزين الكوليسترول الليسوسومي²⁴. مستوى نضوب الكوليسترول يعتمد على مشتق معين المستخدمة. على سبيل المثال ، يستخرج HPαCD الكوليسترول بسعة أقل من مشتق الميثيل ، ميثيل – α – سيكلوديكسترين (MαCD)^24،25، 26^{،27،,2828،29،30}. ومع ذلك ، ومع ذلك ، يمكن أن استخراج الجزيئات الأخرى الكارهة للماء بالإضافة إلى الكوليسترول ، والتي قد تؤدي بعد ذلك إلى آثار غير محددة^31. على النقيض من النضوب ، يمكن إثراء الخلايا والأنسجة على وجه التحديد مع الكوليسترول من خلال العلاج مع α-cyclodextrin التي تم تشبعها مسبقًا بالكوليسترول^23. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج كعنصر تحكم لخصوصية α-cyclodextrins المستخدمة لاستنفاد الكوليسترول^31. استنفاد الكوليسترول من الأنسجة والخلايا أمر مباشر ويمكن تحقيقه عن طريق تعريض الخلايا لمدة 30-60 دقيقة إلى 5 mm MαCD مذابة في المتوسط المستخدم لتخزين الخلايا. هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى انخفاض بنسبة 50٪ في محتوى الكوليسترول (على سبيل المثال، في الخلايا العصبية فرس النهر³²، الشرايين الدماغية الفئران³³). من ناحية أخرى ، يعد مجمع الكوليسترول في الدم لتخصيب الكوليسترول في الأنسجة والخلايا أكثر تعقيدًا ، وسيتم وصفه في قسم البروتوكول.

نهج بديل لإثراء الأنسجة والخلايا باستخدام α-cyclodextrin المشبعة الكوليسترول ينطوي على استخدام LDL, الذي يعتمد على مستقبلات LDL أعرب في الأنسجة / الخلايا¹⁸. في حين أن هذا النهج يوفر ميزة استخدام آلات التوازن الكوليسترول الطبيعي في الخلية ، إلا أن لديها العديد من القيود. أولاً، لا يمكن إثراء الأنسجة والخلايا التي لا تعبر عن مستقبلات LDL باستخدام هذا النهج. ثانياً، تحتوي جزيئات LDL على دهون أخرى بالإضافة إلى الكوليسترول. على وجه التحديد، LDL يتكون من البروتين ApoB₁₀₀ (25٪) والدهون التالية (75٪): ~ 6-8٪ الكوليسترول، ~ 45-50٪ استر cholesteryl، ~ 18-24٪ فوسفوليبيدات، و ~ 4-8٪ triacylglycerols³⁴. وبالتالي ، فإن تسليم الكوليسترول عبر جزيئات LDL غير محدد. ثالثا، قد تكون نسبة الزيادة في محتوى الكوليسترول من قبل LDL في الأنسجة والخلايا التي تعبر عن مستقبلات LDL أقل بكثير من الزيادة التي لوحظت باستخدام السيكلودكسترين المشبعة بالكوليسترول. على سبيل المثال ، في دراسة سابقة ، أدى إثراء الشرايين الدماغية القوارض مع الكوليسترول عن طريق LDL إلى زيادة 10-15٪ فقط في مستويات الكوليسترول^35. في المقابل، أدى إثراء هذه الشرايين مع السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول كما هو موضح في قسم البروتوكول في > 50٪ زيادة في محتوى الكوليسترول (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 1).

تغيير مستويات الكوليسترول في البويضات Xenopus
تشكل البويضات الزينية نظام تعبير غير يروج يستخدم عادة لدراسة وظيفة الخلية والبروتين. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن نسبة الكوليسترول إلى الفوسفوليبيد المولي في البويضات Xenopus هو 0.5 ± 0.1³⁶. بسبب هذا المستوى المرتفع الجوهري من الكوليسترول ، فإن زيادة محتوى الكوليسترول في هذا النظام أمر صعب ، ومع ذلك يمكن تحقيقه باستخدام التشتت اتّسابه من فوسفوليبيدات الغشاء والكوليسترول. الفوسفوليبيدات التي اخترناها لهذا الغرض مماثلة لتلك المستخدمة لتشكيل ثنائيات الدهون البلانية الاصطناعية وتشمل L-α-phosphatidylethanolamine (البابا) و 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS)، كما هو موضح في قسم البروتوكول. يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى زيادة بنسبة 50٪ في محتوى الكوليسترول (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 2).

نهج بديل لإثراء البويضات Xenopus مع التشتت القائم على الفوسفوليبيد ينطوي على استخدام السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول، والتي تشبه الطريقة التي يتم إثراء الأنسجة والخلايا. ومع ذلك ، وجدنا أن هذا النهج منخفض القابلية للاستنساخ والكفاءة ، مع زيادة في متوسط ~ 25٪ في محتوى الكوليسترول. وربما يرجع ذلك إلى اختلاف قدرة التحميل على هذين النهجين (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 3). في المقابل، فقد تبين أن استخدام السيكلوديكسترين لاستنفاد الكوليسترول من البويضات Xenopus يمكن أن يؤدي إلى انخفاض ~ 40٪ في محتوى الكوليسترول³⁶.

هنا، ونحن نركز على إثراء الكوليسترول من أنسجة الثدييات والخلايا من خلال تطبيق السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول، وoocytes Xenopus باستخدام الليبوزومات. ويمكن تسخير كلا النهجين لتحديد تأثير زيادة مستويات الكوليسترول في الدم على وظيفة البروتين. قد تنطوي آليات تعديل الكوليسترول في وظيفة البروتين على تفاعلات مباشرة⁸ و / أو تأثيرات غير مباشرة⁹. عندما يؤثر الكوليسترول على وظيفة البروتين من خلال التفاعلات المباشرة ، فإن تأثير زيادة مستويات الكوليسترول على نشاط البروتين من المرجح أن يكون مستقلًا عن نوع الخلية أو نظام التعبير أو نهج الإثراء. على سبيل المثال، استوعنا هذين النهجين لتحديد تأثير الكوليسترول على G-بروتين مسور ة داخليتصحيح قنوات البوتاسيوم (GIRK) أعرب في myocytes^{الأذين37،}الخلايا العصبية فرس النهر^32،38، HEK293³⁹ الخلايا ، وأوسيتس Xenopus ^32،37. وكانت النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسات متسقة: في جميع الأنواع الثلاثة من خلايا الثدييات وفي البويضات البرمائية الكولسترول upregulationed وظيفة قناة GIRK (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 4،للخلايا العصبية فرس النهر والتجارب المقابلة في oocytes Xenopus). وعلاوة على ذلك، كانت الملاحظات التي أبديت في هذه الدراسات أيضا متسقة مع نتائج الدراسات التي أجريت في myocytes الأذينية^37،40 وخلايا فرس النهر^32،38 معزولة حديثا عن الحيوانات التي تتعرض لنظام غذائي عالي الكوليسترول⁴⁰. وتجدر الإشارة إلى أن تخصيب الكوليسترول في الخلايا العصبية فرس النهر باستخدام MαCD عكس تأثير العلاج أتورفاستاتين المستخدمة لمعالجة تأثير النظام الغذائي ارتفاع الكوليسترول على حد سواء على مستويات الكوليسترول ووظيفة GIRK³⁸. في دراسات أخرى، قمنا بدراسة تأثير الطفرات على حساسية الكوليسترول في قناة البوتاسيوم تصحيح داخلي Kir2.1 باستخدام كل من oocytes Xenopus وHEK293 خلايا⁴¹. مرة أخرى ، كان تأثير الطفرات على حساسية القناة مماثلًا في النظامين.

تطبيقات كل من أساليب التخصيب لتحديد تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في الدم على الجزيئية، الخلوية، وظيفة الجهاز عديدة. على وجه الخصوص ، فإن استخدام مجمعات الكوليسترول السيكلوديكسترين لإثراء الخلايا والأنسجة شائع جدًا ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى خصوصيته. وتشمل الأمثلة الحديثة على هذا النهج تحديد تأثير الكوليسترول على تنشيط قناة HERG والآليات الأساسية⁴²، واكتشاف أن الكوليسترول ينشط مستقبلات البروتين G المقترنة الملساء لتعزيز القنفذ إشارة⁴³، وتحديد دور الكوليسترول في الميكانيكا الحيوية للخلايا الجذعية وadipogenesis من خلال البروتينات الرابط المرتبطة الغشاء⁴⁴. في عملنا الخاص، وأننا تستخدم إثراء أنسجة الثدييات مع MαCD: مجمع الكوليسترول لدراسة تأثير تخصيب الكوليسترول على الوظيفة الأساسية والشخصية الدوائية من قنوات الكالسيوم والجهد المسورة من التوصيلات الكبيرة (BK، MaxiK) في العضلات الملساء الأوعية الدموية^35،45،46. في دراسات أخرى، استخدمنا نهج التشتت القائم على الفوسفوليبيد لإثراء oocytes Xenopus مع الكوليسترول لتحديد أدوار المناطق المختلفة في Kir2.1 وقنوات GIRK في حساسية الكوليسترول^41،47^،48،49، وكذلك لتحديد مواقع ربط الكوليسترول المفترضة في هذه القنوات^{32،50،51.47}