免疫荧光和定量PCR对白蝇组织中白蝇病毒的定位和定量

在过去的几十年里，贝戈莫病毒（贝戈莫病毒属，家族双子病毒）已经^{给全世界许多}蔬菜、纤维和观赏作物的生产造成了严重损害。贝戈莫病毒由白蝇贝米西亚·塔巴奇（赫米特拉：阿莱罗迪达）持续传播，这是一种复杂的物种，包含超过35个神秘的物种^2，3。白蝇病毒可能直接或间接地影响白蝇的生理和行为，如粪便^4、长寿⁴和宿主偏好^5、6。此外，即使在相同的实验条件下^{，在相同的}实验条件下，特定白蝇病毒物种/菌株的传播效率也因不同的白蝇神秘物种^{而异，这表明}白蝇与白蝇之间存在复杂的相互作用。为了更好地了解白蝇-白蝇病毒相互作用背后的机制，在白蝇组织中对病毒进行定位和定量至关重要。

番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）是一种在以色列首次报告的果子病毒，但如今对全世界番茄生产造成了严重破坏^。由于其经济重要性，它是研究最好的贝戈病毒¹³之一。像其他单部分体细胞病毒一样，TYLCV是一种单链圆形DNA病毒，其基因组大小约为2，800个核苷酸^14。虽然仍在争论中，几行证据支持在白蝇^15，16，17复制TYLCV。此外，TYLCV粒子和白蝇蛋白的相互作用已经报告6，18，19，20。对于病毒传播，白蝇通过喂食受病毒感染的植物获得TYLCV，病毒通过食物管到达食道，穿透中肠道壁到达溶血区，然后转移到主要的唾液腺（PSG）。最后，病毒通过唾液管沿着唾液管道进入植物噬菌体^21。此外，几项研究表明，TYLCV能够从雌性白蝇的转传传给它们的后代^22，23。换句话说，为了实现生产性传播，病毒必须克服白蝇体内的细胞屏障，才能从一个组织转移到另一个组织。在跨越这些障碍期间，白蝇和病毒蛋白之间很可能发生相互作用，这可能决定病毒的传播效率。

免疫荧光是蛋白质分布分析常用技术。抗体与其抗原结合的特异性是免疫荧光的基础。由于TYLCV的经济意义，针对TYLCV涂层蛋白的单克隆抗体已经开发出来，为病毒²⁴的局部化提供了一种高度敏感的方法。定量PCR（qPCR）允许对核酸进行敏感和具体的定量。该技术最常基于水解探针（例如，TaqMan）或荧光染料（如SYBR绿色）检测。对于基于水解探针的qPCR，需要特定的探头，从而增加了成本。荧光染料qPCR更简单，更具成本效益，因为标记的放大里昂特异性杂交探头不需要^25。到目前为止，一些研究已经使用免疫荧光和qPCR以及其他方法来研究复杂的果子病毒-白蝇相互作用。例如，Pan等人对白蝇组织中的病毒进行了qPCR和免疫荧光分析，发现白蝇物种亚洲II 1和东亚小1（MEAM1）之间传播烟草卷曲病毒的能力差异是由于该病毒能够有效地穿过亚洲的中肠道壁，而不是MEAM1^8。同样，虽然地中海（MED）白蝇可以轻易传播TYLCV，但它们不能传播番茄黄叶卷曲中国病毒（TYLCCNV）。使用PSG中病毒的免疫荧光检测对选择性传播进行了研究，结果表明TYLCCNV不容易穿过MED白蝇²⁶的PSG。TYLCV CP和白蝇中古的自噬标记蛋白ATG8-II的免疫荧光共定位表明，自噬在抑制白蝇²⁷的TYLCV感染中起着关键作用。

在这里，我们以TYLCV为例，描述了一种通过免疫荧光技术在白蝇中肠道、PSG和卵巢中定位的果子病毒的协议。该技术包括用原抗体和染料标记的二级抗体进行解剖、固定和孵育。荧光信号显示病毒蛋白在白蝇组织中的位置，然后可以在共聚焦显微镜下检测到。更重要的是，该协议可用于共同地化果病毒和白蝇蛋白。我们进一步描述了在白蝇中古、PSG、淋巴和卵巢中使用SYBR绿色qPCR对TYLCV进行定量的协议，该协议可用于比较不同白蝇组织样本中的病毒量。