Clarifying and Imaging <em>Candida albicans</em> Biofilms

Frederick Lanni; Katherine Lagree; Manning  Y. Huang; Lan Yan; Carol  A. Woolford; Aaron  P. Mitchell

doi:10.3791/60718

JoVE Journal > Immunology and Infection

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Immunologie und Infektion

Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme

Published: March 06, 2020

doi:

10.3791/60718

Frederick Lanni¹, Katherine Lagree¹, Manning Y. Huang¹, Lan Yan², Carol A. Woolford¹, Aaron P. Mitchell¹

¹Department of Biological Sciences,Carnegie Mellon University, ²Department of Pharmacology,Second Military Medical University

Summary

Um die internen Merkmale von Candida albicans Biofilmen zu sehen und zu quantifizieren, bereiten wir feste intakte Proben vor, die durch Brechungsindex-Matching geklärt werden. Dann kann die optische Schnittmikroskopie verwendet werden, um dreidimensionale Bilddaten durch die volle Dicke des Biofilms zu erhalten.

Abstract

Der mikrobielle Pilz Candida albicans kann einen Wechsel von der kommensalen Kolonisation zu Virulenz durchlaufen, die stark mit seiner Fähigkeit korreliert, von Hefe-Form-Wachstum zu Hyphenwachstum zu wechseln. Zellen, die diesen Prozess einleiten, werden mit der daraus resultierenden Entwicklung einer Biofilmkolonie an Oberflächen und einander haften. Dies tritt häufig nicht nur auf Schleimhautgewebeoberflächen bei Hefeinfektionen auf, sondern auch auf medizinischen Implantaten wie Kathetern. Es ist allgemein bekannt, dass Biofilmzellen gegen Antimykotika resistent sind und dass Zellen, die aus dem Biofilm vergossen werden, zu gefährlichen systemischen Infektionen führen können. Biofilme reichen von stark transluzent bis undurchsichtig durch refraktive Heterogenität. Daher sind Pilzbiofilme durch optische Mikroskopie schwer zu untersuchen. Um interne strukturelle, zelluläre und subzelluläre Merkmale zu visualisieren, klären wir feste intakte Biofilme durch schrittweisen Lösungsmittelaustausch bis hin zu einem Punkt optimalen Brechungsindex-Abgleichs. Bei C. albicans Biofilmen wird eine ausreichende Klärung mit Methylsalicylat (n = 1.537) erreicht, um eine konfokale Mikroskopie von der Spitze zur Basis in 600 m Biofilmen mit geringer Dämpfung zu ermöglichen. In diesem Visualisierungsprotokoll skizzieren wir Phasenkontrastrefraktometrie, das Wachstum von Laborbiofilmen, Fixierung, Färbung, Lösungsmittelaustausch, den Aufbau für konfokale Fluoreszenzmikroskopie und repräsentative Ergebnisse.

Introduction

Candida albicans ist ein mikrobieller Pilz, der typischerweise beim Menschen vorkommenkann. Es ist von grundsätzlichem Interesse für Biologen, weil der Organismus mehrere Morphologien hat. Als Reaktion auf bestimmte Umwelthinweise oder Stressoren werden beispielsweise hefeförmige angehende Zellen zu fadenförmigem Wachstum als Septikulierende Ketten hochlängsseitiger Zellen, die als Hyphen bekannt sind, umschalten. Der Übergang ist wichtig als Beispiel für die phänotypische Expression einer Umstellung zwischen einem einzelligen und einem mehrzelligen Genexpressionsprogramm. Ebenso ist C. albicans von biomedizinischem Interesse, weil der Organismus ein bekannter opportunistischer Erreger ist. Es ist verantwortlich für Schleimhauthefe-Infektionen wie Soor (orale Candidiasis), Genitourinäre Infektionen, und eine Ursache für gefährliche invasive oder systemische Infektionen bei immunologisch geschwächten Patienten.

Das Potenzial dieses Organismus für Virulenz ist eng mit seinen multiplen Morphotypen und anderen Aspekten seiner genetischen Vielseitigkeit¹^,²^,³^,⁴verbunden. Die Keimröhrenverlängerung, die erste sichtbare Stufe des Übergangs zum Hyphalwachstum, tritt mit ausreichender Schnelligkeit auf, um verschlungenen C. albicans-Zellen zu ermöglichen, aus Phagozyten auszubrechen und dadurch einer frühen Phase der zellulären Immunantwort des Wirts zu entkommen⁵. Zusätzlich wird der Filamentierung ein großer Anstieg der Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Oberfläche-Haftung vorausgestellt, die auf die regulierte Expression mehrerer Klassen von Zellwandproteinen zurückzuführen ist, die als Adhäsine⁶^,⁷^,⁸^,⁹bekannt sind. Unter den verschiedensten Bedingungen führt die Kombination von Adhärenz und Filamentierung zu einer dramatischen Verschiebung vom planktonischen, einzelzellulären Wachstum hin zu oberflächenassoziiertem kolonialem Wachstum, das einen Biofilm bildet. C. Albicans Biofilme können sich auf gängigen implantierten Medizinprodukten wie Venenkathetern entwickeln. Disseminierte Infektionen können entstehen, wenn solche Biofilme beginnen, Hefe-formierte Zellen abzuzapfen und sie in zirkulierendes Blut zu vergießen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Biofilmzellen resistenter gegen Antimykotika sind als planktonische Zellen¹⁰^,¹¹, die zum Teil auf einen abgesenkten Stoffwechsel zurückzuführen sein können¹². Darüber hinaus kann die hohe Gesamthaftung eines Biofilms die Verankerung für ein effizientes invasives Wachstum von Hyphen in Wirtsgewebe¹liefern.

Die optische Klärung von C. albicans Biofilmen durch Brechungsindex-Matching hat unsere Fähigkeit, die Struktur dieser mikrobiellen Gemeinschaft zu visualisieren und Zusammenhänge zwischen Genexpression und Phänotyp zu entdecken, stark beeinflusst. Biofilme, die im Labor auf Testflächen unter flüssigem Kulturmedium für 48 h angebaut werden, erscheinen als eine weißliche Beschichtung, die dicht genug und dick genug ist, um undurchsichtig zu sein (Abbildung 1). Daher sind viele interessante phänotypische Merkmale des Biofilms verborgen. Die 24 h Wild-Biofilme, die in YPD, RPMI-1640 oder Spider Medium mit einer Reichweite von 37 °C bis zu 300 m Dicke angebaut werden, mit 48 h Biofilmen, die oft 500 m erreichen. Die Deckkraft ist auf die Lichtstreuung zurückzuführen, die durch refraktive Heterogenität entsteht: Die Pilzzellwand ist refraktiver als das umgebende Medium und das Zytoplasma etwas refraktiver als die Zellwand. Die daraus resultierende hohe optische Dichte eines nativen Biofilms verdeckt alle Strukturen, die mehr als 30 m tief sind, wenn man sie mit einem herkömmlichen Mikroskop oder sogar einem konfokalen Scanner betrachtet (Abbildung 2). Ein hohes Maß an Klärung kann jedoch durch das Infiltrieren fester Biofilme mit einer flüssigkeitsstarken Flüssigkeit mit hohem Brechungsindex erreicht werden, die in etwa der Refraktivität wichtiger zellulärer Bestandteile entspricht. Nach der Klärung kann die Bildgebung bei Submikron-Auflösung durch konfokale Mikroskopie durch die gesamte Dicke fast jedes C. albicans Biofilms¹³durchgeführt werden. Bei Wild-Exemplaren ist leicht zu erkennen, dass Biofilme aus lang verschränkten Hyphen, Clustern von budded Hefe-Form-Zellen oder Pseudohyphalzellen, Leerräumen und einer gewissen Menge extrazellulärer Matrix bestehen. Darüber hinaus werden Biofilme im Allgemeinen geschichtet, die räumlich variantenweise morphologische Unterschiede in Zelltyp, Zelldichte und das Vorhandensein von angehenden oder verzweigten Zellen zeigen. Viele Variationen in einem oder mehreren dieser Merkmale wurden in Biofilmen beobachtet, die von mutierten Stämmen¹⁴^,¹⁵entwickelt wurden. Zusätzlich zeigen Reporterstämme in situ räumliche Unterschiede in der Genexpression¹⁶^,⁹^,¹³. Der überraschende Klärungsgrad, der mit diesem relativ einfachen und kostengünstigen Ansatz erzielt werden kann, lässt auch erkennen, dass viele Biofilme apikale Hyphen und basalinvasive Hyphen enthalten, die sich bis in Millimeterentfernungen ausdehnten.

In diesem Visualisierungsprotokoll zeigen wir die Fixierung, Etikettierung, Klärung und Abbildung eines C. albicans Biofilms mit einem einfachen Zellwandmarker als Fleck. Der Ursprung der vorliegenden Version des Protokolls ist die verbesserte Klarheit, die wir beobachteten, als Formaldehyd-fixierte Biofilme mit 97% Glykolmethacrylat (GMA) infiltriert wurden, das dann polymerisiert wurde, um den Biofilm in einen harten Kunststoff mit einem mäßig hohen Brechungsindex einzubetten (n = 1,49). Wir verwendeten dann die konventionelle Phasenkontrastmikroskopie und eine Reihe von refraktiven Indexreferenzflüssigkeiten, um den Kontrastpunktumkehrpunkt (maximale Transparenz) des Biofilms genauer zu bestimmen (Abbildung 3). Bei C. albicans Biofilmen trat dies nahe n = 1,530 auf, was überraschend hoch war, da eine dichte Proteinstruktur wie Haarkeratin nur geringfügig refraktiver ist (1,54–1,55). Obwohl es sich am oberen Ende des optimalen Bereichs in Abbildung 3befindet, haben wir Methylsalicylat (Öl von Wintergrün, n = 1.537) im aktuellen Protokoll verwendet, weil es seit langem als Klärungsmittel für die Mikroskopie in der Embryologie und Histologie verwendet wird, es hat eine geringe Toxizität und einen niedrigen Dampfdruck, und es hat hervorragende Ergebnisse in unseren Studien mit moderaten NA-Ölimmer-Optiken.

Vier Punkte sind hier zu beachten:

(1) Mit wenigen Ausnahmen ist die ideale Situation in der Mikroskopie, dass der Brechungsindex der Probe dem Brechungsindex der Objektivlinsen-Tauchflüssigkeit¹⁷^,¹⁸^,¹³gleich sein sollte. Für dreidimensionale (3D) Bildgebungsstudien, bei denen eine tiefen Fokussierung notwendig ist, ist dies immer wichtig.

(2) Unser Versuchsergebnis für eine optimale Clearingung (n = 1.525–1.535) ist etwas höher als Standard-Tauchöle (n = 1.515, 1.518) und verstößt somit gegen Punkt (1) und führt somit eine Quelle sphärischer Aberration bei Verwendung von Standard-Öl-Immersionsoptiken ein. Eine Lösung für dieses Problem ist die Verwendung eines Ziels, das für einen Tauchindex im höheren Bereich entwickelt wurde. Aufgrund des wieder auflebenden Interesses an bildgeclearten Proben werden Spezialziele mit der erforderlichen Korrektur verfügbar. Die andere Lösung besteht darin, den Index des klärenden Mediums auf 1,515 oder 1,518 um eine geringe Menge Butanol (n = 1,399) für eine optimale Öltauchleistung anzupassen und die leicht abgebaute Klarheit zu akzeptieren.

(3) Die Mikroskopie intakter Biofilme (und anderer Proben in diesem Maßstab) erfordert einen erheblichen Arbeitsabstand, um die Probendicke aufzunehmen. Dies ist eine wichtige praktische Überlegung. Ein langer Arbeitsabstand begrenzt die Optik auf eine moderate numerische Blende (NA = 0,6–1,25), was die Auflösung, aber auch die Schwere der sphärischen Aberration begrenzt.

(4) Der optimale Brechungsindex zur Klärung kann bei anderen Arten fester Proben unterschiedlich sein. Die Proben sollten entsprechend anhand des Phasenkontrasts und einer Reihe von refraktiven Indexreferenzflüssigkeiten getestet werden, wie in Abbildung 3dargestellt.

Protocol

1. Wachstum von Biofilmkulturen VORSICHT: Candida albicans ist ein menschlicher Erreger. In einigen Institutionen erfordert die Kultur dieses Organismus BSL-2-Eindämmung. Ausgewählte Sorte auf einer Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Agarplatte ausziehen und 48 h bei 30 °C wachsen. Wählen Sie einzelne Kolonien von der Platte aus, um 5 ml YPD-Medium in 15 ml Kulturröhren für nächtliches aerobes Wachstum (Karussellrotator, 52–55 U/min) bei 30 °C zu impfen. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einer 40- bis 50-fachen Verdünnung der Übernachtungskultur. Berechnen Sie den Verdünnungsfaktor, der erforderlich ist, um die Zelldichte auf 3 x 106 Zellen/ml für Silikonsubstrate oder 0,6–1,2 x 106 Zellen/ml für Abdeckungsglasoberflächen zu senken, die mit Concanavalin-A (ConA) oder Weizenkeim-Agglutinin (WGA) behandelt wurden (siehe Diskussion). Für das Biofilmwachstum in einer 12-Well-Platte(Abbildung 1)2,0 ml steriles Filamentierungsmedium in jeden Brunnen geben und die Platte in einem befeuchteten Inkubator auf 37 °C erwärmen. Eine Vielzahl von Medien induziert eine Filamentierung, stärker bei einer erhöhten Temperatur (37 °C) und mit zugesetztem Serum. Fetales Rinderserum (FBS) wird empfohlen. Empfohlene Medien sind YPD, Spider-Mannitol oder RPMI-1640. Mit steriler Pinzette ein vorbereitetes Substrat in jeden Brunnen in die erwärmte Platte geben und Blasen lösen. Fügen Sie das Inokulum aus der Nachtkultur hinzu, um die in Schritt 1,3 empfohlene Zelldichte in jedem Brunnen zu erreichen. Ein Brunnen ohne Inokulum dient als visuelles Rohling und zur Kontrolle gegen Verunreinigungen. Legen Sie die Platte 90 min auf einen 60-um-m2-Orbitalmischer in einem befeuchteten 37 °C-Luft-Inkubator, um Zeit für die Zellhaftung zu lassen. Nach 90 min die mittleren und nicht angeschlossenen Zellen entfernen, mit sterilem Medium oder Phosphatgepufferter Kochstoff (PBS) waschen und geimpfte Substrate in Kulturgerichte oder eine andere Multiwellplatte mit vorgewärmtem Filamentierungsmedium legen. Mit Multiwell-Platten ist es sehr praktisch, eine zweite Platte für den Waschschritt und eine dritte Platte mit 2,0 ml vorgewärmtem Medium pro Brunnen zu verwenden, um die gewaschenen geimpften Substraten zu erhalten. Sterilisieren Sie pinnzere vor jedem Transfer. Bringen Sie die Platte in den 37 °C befeuchteten Umgebungsluft-Inkubator zurück und wachsen Sie die Biofilme bis zu 48 h mit 60 Umdrehungen pro Minute Orbitalmischung zur Belüftung. Es sollte wenig planktonisches Wachstum in jeder Kultur geben, es sei denn, der sich entwickelnde Biofilm vergießt Hefe-Form-Zellen. Ein auf diese Weise angebauter Biofilm ist in Abbildung 1dargestellt. 2. Probenverarbeitung für die Bildgebung ACHTUNG: Aldehydfixative sind flüchtig und gefährlich. Bereiten Sie fixative Verdünnungen in einer Dunstabzugshaube vor, nicht in einem Biosicherheitsschrank. Setzen Sie Fixative nicht in Inkubatoren, die für lebende Zellen verwendet werden. Arbeiten Sie mit verdünnten Fixativen in abgedeckten Gerichten in einer Dunstabzugshaube oder einem gut belüfteten Tischbereich. Entsorgen Sie Fixative und Post-Fix-Waschlösungen als Sondermüll. Frisches fixatives, 4% Formaldehyd oder Paraformaldehyd in PBS zubereiten, wahlweise mit bis zu 2% Glutaraldehyd. Formalin verdünnt auf 4% kann für Routinearbeiten verwendet werden.HINWEIS: Insbesondere Glutaraldehyd wird die Breitband-Autofluoreszenz erhöhen und die Fluoreszenz von expressiblen Tags wie dTomato abschwächen. Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Probe und ersetzen Sie es durch PBS, um Serumproteine zu verdünnen, oder übertragen Sie den Biofilm auf seinem Substrat für einige Minuten auf PBS. Übertragen Sie die Probe in fixativ, und stellen Sie die abgedeckte Schale auf einem langsamen Orbitalmischer für 20 min. Verlängern Sie den Zeitraum bei der Verarbeitung dickerer Proben (siehe Diskussion). Jedem Gericht sollte ein ausreichendes Fixierungsvolumen hinzugefügt werden, um das gesamte Biofilmwachstum, einschließlich der einzelnen auf den Innenseiten der Schale, einzutauchen. Entfernen Sie die Fixierung und füllen Sie die Schale mit PBS, um die Restfixierung auszuwaschen. Entsorgen Sie das Fixativ als sonderstofflichen Abfall. Wiederholen Sie mehrere kurzfristige Wässser, dann längere Wähes, damit zeitgeben, dass das Restfixativ aus dem Biofilm oder Agarblock diffundiert. Die Waschzeit hängt von der Zeit ab, die für die Fixierung zulässig ist (siehe Diskussion). Die benötigte Menge an Flecken hängt von der Biofilmmasse ab. Entfernen Sie alle Biofilme aus Nicht-Probenbereichen der Kulturschale vor der Färbung, oder übertragen Sie das feste Exemplar vor der Färbung in eine neue Schale. Lassen Sie den Biofilm nicht ab- oder austrocknen. Halten Sie es in PBS eingetaucht. Fügen Sie den Fleck in die Schale (siehe Diskussion) und setzen Sie die bedeckte Schale auf einem langsamen Orbitalmixer über Nacht (siehe Diskussion). Vor Licht schützen. Am Morgen die Färbelösung entfernen und die Schale mit PBS auffüllen, um den ungebundenen Fleck zu verdünnen. Stellen Sie die Gerichte auf langsamen Orbitalmixer für mehrere Stunden zu destain. 3. Klärungsprotokoll: Biofilme über impermeant Substrata Geklärte Biofilme sind visuell schwer zu erkennen. Markieren Sie daher bei Bedarf eine Seite jedes Substrats mit einem Kratzer, um die Seite für die Impfung zu kennzeichnen. Verwenden Sie beschriftete lange Pasteur Pipetten für alle nachfolgenden Abfall- und Lösungsmittelübertragungen, um eine Kreuzkontamination der Lösungsmittel zu vermeiden. Übertragen Sie den fixierten Biofilm mit einer Pinzette in einer 20 ml Glasdurchstechflasche mit nach oben gerichtetem Biofilm von PBS auf 5 ml 50:50 PBS:Methanol. Manuelles Mischen mit Orbitalbewegung in 1 min Intervallen für 5 min (siehe Diskussion). Entfernen Sie das Lösungsmittel in eine Abfallflasche, wobei Sie vorsichtig sind, um den Kontakt zwischen Pipette und Biofilm oder dem Biofilm und der Durchstechflasche zu vermeiden. Mit 3 ml ordentlichem Methanol vorsichtig nachfüllen. Manuelle sendemittelmit Orbitalbewegung in 1 min Intervallen für 3 min. Entfernen Sie das Lösungsmittel in eine Abfallflasche und füllen Sie es sofort mit 5 ml Methanol auf. Mit Orbitalbewegung in 1 min Intervallen für 5–10 min manuell mischen. Das Lösungsmittel in die Abfallflasche nehmen und sofort mit 3 ml Methanol nachfüllen. Biofilme sehen an dieser Stelle oft undurchsichtiger aus als ihr ursprüngliches Aussehen. Entfernen Sie das Lösungsmittel in die Abfallflasche und füllen Sie die Durchstechflasche sofort mit 5 ml 50:50 Methanol: Methylsalicylat auf. Manuelles Mischen mit Orbitalbewegung in 1 min Intervallen für 5–10 min. Der Biofilm sollte in diesem gemischten Lösungsmittel halbtransparent sein. Entfernen Sie das Lösungsmittel in eine Abfallflasche. Die Durchstechflasche vorsichtig mit 3 ml ordentlichem Methylsalicylat (MS) nachfüllen. Manuelle sendemittelmit Orbitalbewegung in 1 min Intervallen für 3 min. Entfernen Sie das Lösungsmittel in die Abfallflasche und füllen Sie es sofort mit 5 ml ordentlichem MS auf. Manuelles Mischen mit Orbitalbewegung in 1 min Intervallen für 5–10 min. An dieser Stelle sollte der Biofilm transparent sein. Entfernen Sie das Lösungsmittel in die Abfallflasche, und füllen Sie die Durchstechflasche sofort mit 3 ml ordentlichem MS auf. Der verarbeitete Biofilm ist in diesem Lösungsmittel stabil. Für Biofilme auf Agar (siehe Diskussion) verlängern alle Austauschzeiträume, um Wasser- und Lösungsmitteldiffusion durch den Agar zu ermöglichen. Die erforderlichen Zeiträume können mit einem Stromsparenden Sezierenmikroskop mit Dunkelfeldbeleuchtung geschätzt werden, um den Lösungsmittelvorsprung in den Agar zu sehen. Das Protokoll erreicht eine gute Klärung und keine größeren Schrumpfeffekte, wenn 2% Agar verwendet wird, aber der geklärte Agar wird kondensieren, wenn er beim Umgang mit einer Pinzette gedrückt wird. Die Verwendung eines Spachtels wird empfohlen. 4. Imaging Setup für konfokale Mikroskopie Die folgenden Schritte sind für die Verwendung eines invertierten Mikroskops vorgesehen. Verwenden Sie eine lösungsmittelbeständige Schale mit einem Abdeckglasboden, um die invertierte Probe auf der Mikroskopstufe zu halten (siehe Diskussion). Bereiten Sie Abstandshalter auf die Unterstützung der invertierten Probe vor. Verwenden Sie kleine Rechtecke aus Mikroskop-Dias (1.000 m dicke), Deckgläser (170 m) oder 13 mm Silikonringe (330 m, siehe Tabelle der Materialien), die bei Bedarf gestapelt werden können. Die Ringe in Methylsalicylat für 1 h vortränken, um die Fokusdrift durch Schwellung zu minimieren. Für einen Biofilm auf einem medizinischen Silikonquadrat, invertieren Sie das Quadrat (d. h., drehen Sie es Biofilm nach unten) und setzen Sie es auf einen Abstandsraum in einem Pool von Methylsalicylat in der Schale (Abbildung 2). Achten Sie darauf, Blasen unter der Probe zu vermeiden. Montieren Sie die Schale fest auf der Bühne des Mikroskops und machen Sie Öl in Kontakt mit dem Ziel (siehe Diskussion). Stellen Sie die MS-Menge in der Schale so ein, dass der Meniskus die Probe durch Oberflächenspannung fest auf dem Abstandsraum hält. Legen Sie ein Tröpfchen MS auf das invertierte quadratische Substrat, um die Lichtstreuung von der matten Oberfläche zu reduzieren, und bedecken Sie die Schale mit einer Glasplatte, um die Verdunstung zu begrenzen. Warten Sie einige Minuten, bis sich die Probe vor der Bildgebung auf die Abstandshalter einlässt. Verwenden Sie durchsegangenes Licht, um das Sichtfeld visuell zu inspizieren und die aktuelle Fokusposition relativ zu den apikalen und basalen Regionen des invertierten Biofilms zu lokalisieren. Stellen Sie den Kondensator, der die numerische Blende (INA) beleuchtet, auf ein Minimum (Schließen der Kondensator-Iris) um den Kontrast zu erhöhen, da sonst der geklärte Biofilm nahezu unsichtbar ist. Schalten Sie nach Getanheit die übertragene Lichtquelle aus. Wechseln Sie zur konfokalen Fluoreszenz und legen Sie die unteren und oberen Grenzwerte des seriellen Fokus-Bildstapels fest, der für die Spannweite des Biofilms erforderlich ist. Upward Focus Drive Stepping, das empfohlen wird, zeigt zuerst dislodged Zellen, die sich auf dem Deckglas niedergelassen haben und sehr lange apikale Hyphae, die auf dem Glas ruhen. Am oberen Ende der Sequenz sollten die Gründerzellen am Substrat an der Basis des Biofilms haften doneriert werden. Legen Sie den Lochdurchmesser, den Pixelabstand in der Bildebene und das Fokusschrittsschrittinkrement mithilfe der allgemeinen Kriterien fest, die in der Diskussion beschrieben sind.

Representative Results

Biofilme wie die in Abbildung 1 sind stark transluzent bis undurchsichtig, werden aber routinemäßig durch den Einsatz des obigen Protokolls geklärt und abgebildet. Abbildung 2 zeigt die starke Dämpfung der Fluoreszenz mit Fokustiefe in einem festen Biofilm in PBS im Vergleich zum gleichen Biofilm nach Indexabgleich. Wie in Abbildung 3dargestellt, kann mit serienmäßig mischbaren Lösungsmitteln mit steigendem Brechungsindex das Maximum an Klarheit schnell geschätzt werden. Dies wird durch die herkömmliche Phasenkontrastmikroskopie verfeinert, um den Punkt des minimalen Kontrasts (maximale Transparenz) zu finden. Es ist offensichtlich, dass dieses Optimum nicht durch einen homogenen Indexabgleich erreicht wird. Dies liegt daran, dass sich subzelluläre Strukturen im Brechungsindex leicht unterscheiden. In diesem Fall trat die Kontrastumkehr in der Zellwand mit einem etwas niedrigeren Lösungsmittelindex auf als im Zytoplasma. Bei Candida albicans Biofilmen tritt das Optimum nahe n = 1.530 auf. Die 48 h Wildtyp und cak1 DX mutierten Biofilme in Abbildung 4A waren 500 ‘m dick, aber die Hefezellen an der Basis wurden fast so scharf abgebildet wie die apikalen Zellen. Ebenso war, wie in Abbildung 4Cdargestellt, die Dämpfung der Fluoreszenz nicht stark mit der Fokustiefe korreliert. Abbildung 5 zeigt invasive Hyphen im Agar, Hunderte von Mikrometern unter einem Oberflächenbiofilm. Reife invasive Hyphen produzieren konsequent seitlich angehende Hefe proximal zur Septa in der Hyphalkette, was zu Subkolonien von hefeähnlichen Zellen in regelmäßigen Abständen entlang einer invasiven Hypha führt. Abbildung 1: Biofilmkulturen vor der Klärung. Ein 24-h-Biofilm, der aus einem Isolierten eines ergänzten efg1-/–Stamms von C. Albicans in einer 12-Well-Platte auf einem Silikonquadrat in RPMI-1640 flüssigem Medium, ergänzt mit 10% FBS, angebaut wird. Der sterile Rohling ist in gut C4. Inset zeigt geschnittenen Querschnitt von 96-stunden-Wildbiofilm, der in einer 6-Well-Platte auf einer 3,75 mm Agarbasis im selben Medium angebaut wird und invasive Hyphen zeigt. Beide Panels sind in der gleichen Größenordnung. Maßstabsleiste = 2,0 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Verbesserung der tiefen Bildgebung durch Indexabgleich. Die Abbildung zeigt Seitenansichtsprojektionen von konfokalen Bildstapeln aus einem 48 h wilden Biofilm, der mit ConA-Alexafluor 594 fixiert und gebeizt wurde. (A) Die Probe wurde in PBS mit einem 63x 1,0 NA-Direkt-Wasser-Immersion-Objektiv abgebildet. Die Dämpfung war bei einer Fokustiefe von 30 m stark. (B) Nach Klärung durch Protokollschritte 3.3–3.8 wurde derselbe Biofilm in Methylsalicylat mit minimaler Dämpfung mit einem 40x 0,85 NA-Ölimmerziel abgebildet. Nach Hintergrundsubtraktion und Seitenansichtsprojektion der 3D-Bildstapel wurden die 40-fachen Daten räumlich neu skaliert, um den 63-fachen Daten für den Vergleich zu entsprechen. (C) Schematische sertierte Darstellung der invertierten Montage der gelöschten Probe (von MS) durch Übertragung auf MS in einer schwarz anodisierten Aluminiumschale mit zementiertem Deckelglasboden (siehe Diskussion). Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Die Phasenkontrastrefraktometrie zeigt eine Kontrastumkehr zellulärer Merkmale im Bereich des optimalen Indexabgleichs. Feste Biofilme auf Deckgläsern wurden von PBS in Methanol, dann in Xylol (n = 1.496) ausgetauscht. Diese Biofilme wurden dann jeweils aus Xylol in eine Reihe von refraktiven Indexreferenzflüssigkeiten (Serie E, Cargille Laboratories, siehe Tabelle der Materialien)ausgetauscht und nebeneinander betrachtet, um den Indexbereich mit höchster Transparenz zu bestimmen. (obere Platte) Phasenkontrastbilder: Ein Biofilm wurde seriell zwischen Xylol und einem schmalen Satz referenzieller Flüssigkeiten in diesem Bereich ausgetauscht. Nach jedem Austausch wurde das gleiche Feld verlegt und durch ein Deckglas mit einem 40x 0.85 NA Ph2 Öl-Immersions-Kontrastobjektiv und Ph2-Kondensator betrachtet. Alle Bilder wurden mit der gleichen Lampeneinstellung und Kamerabelichtung aufgenommen, um Änderungen genau anzuzeigen. Mit steigendem Index wird die Kontrastumkehr zuerst bei n = 1.530 für die Zellwand gesehen, gefolgt von Zytoplasma bei n = 1.535. Skalenbalken = 10 m. (unteres Panel) Grafik zeigt das Minimum an durchschnittlicher Biofilmhelligkeit an der Stelle maximaler Transparenz. Starke Streuung des Lichts innerhalb des Biofilms bewirkt, dass die durchschnittliche Helligkeit das leere Feld überschreitet. Isolierte Zellen erscheinen dunkler als das leere Feld, bis zur Kontrastumkehr im Bereich 1.530–1.535. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Tiefe Bildgebung von mutierten und wilden Biofilmen des Typs C. albicans. Ein Wild-Stamm (DAY185) und eine zellzyklusbezogene Proteinkinase verminderten Expressionsstamm (cak1 DX)14 wurden bei 37 °C für 48 h auf Silikonsubstraten in flüssigem YPD-Medium angebaut. Die Biofilme wurden fixiert, mit ConA-Alexafluor 594 gebeizt und mit dem Lösungsmittelaustauschprotokoll in Methylsalicylat geklärt. Die konfokale 3D-Mikroskopie zeigte, dass beide Biofilme 500 m dick waren. Bilddaten wurden in ImageJ oder Fidschi (https://imagej.nih.gov/ij/ oder http://fiji.sc) in das 32-Bit-Format konvertiert und dann mit der Funktion Hintergrund subtrahieren mit einem 50-Pixel-Rolling-Ball-Radius verarbeitet, um negative Pixel auf Null zu setzen, erneut zu slicieren und mit maximaler Intensitätsprojektion Seitenansichten zu erzeugen. (A) Axial- und Seitenansichtsprojektionen: Der Wildtyp-Biofilm wuchs auf eine Dicke von 502 m, wie in der Seitenansichtsprojektion des konfokalen Bildstapels mit 558 Ebenen zu sehen ist. Skalenbalken = 100 m. (linke Handpaneele) 40-ebenen Axialprojektionen von Spitze (oben) bis Basis (unten) zeigen die Variation der Zelltypen in verschiedenen Schichten des Biofilms. Dieses Beispiel zeigte charakteristische Wildtypstruktur: Anhähnte Zellen an der Basis führen zu Hyphen, die in eine dichte mittlere Zone von Pseudohyphal und hefeähnlichen Zellen aufsteigen. Oberhalb der Mittelzone tauchten Hyphen wieder auf und führten zu Clustern von angehender Hefe. Die lange Hyphen, die in der apikalen Zone zu sehen waren, erstreckten sich wahrscheinlich in das Kulturmedium im lebenden Biofilm, falteten sich aber während der Probenverarbeitung auf die Oberfläche des Biofilms. Der cak1 DX Biofilm wuchs auf eine Dicke von 500 m, wie in der Seitenansichtsprojektion des 556-Ebenen-Bildstapels zu sehen ist. Diese Mutante, von der bekannt ist, dass sie in Ermangelung von induzierenden Spannungen14ein fadenförmiges Wachstum durchläuft, erzeugte eine dramatisch andere Architektur. Wie sowohl in der Seitenansicht als auch in den axialen Projektionen (rechte Hand), führten viele verzweigte Zellen zu radialen Auswüchsen. (B) Beispiele für verzweigte Hyphen innerhalb des cak1 DX Biofilms. Skalenbalken = 10 m. (C) Fluoreszenzdämpfung mit Tiefe im geklärten Wildtyp-Biofilm wurde quantifiziert, indem Hintergrundpixel maskiert und dann das durchschnittliche digitale Signal für alle Nicht-Hintergrundpixel in jeder Bildebene berechnet wurde. Mit Ausnahme von apikalen Hyphen, die vom Lektin hell markiert werden, gab es keinen starken Dämpfungstrend mit Fokustiefe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Invasive Hyphen im Agar. C. albicans hyphae in einem Oberflächenbiofilm durchdringt ein Agar-Substrat zu Millimeterabständen (siehe Abbildung 1). Nach der Klärung können invasive Strukturen durch den Biofilm nach unten oder von der Unterseite des Agars nach oben betrachtet werden. Letzteres verlangt mehr Arbeitsabstand. Alternativ kann der Agar nach der Fixierung, aber vor dem Färben und dem Lösungsmittelaustausch vertikal mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge in 1-2 mm Platten geschnitten werden, die dann seitlich gedreht und nach der Färbung und Klärung direkt in der Seitenansicht abgebildet werden können. Dieses Verfahren wird empfohlen. In dieser Projektion eines quadratischen Sichtfeldes von 213 m wurde eine Regenbogen-Farbskala verwendet, um axiale Positionen über einen Bereich von 75 m zu kodieren: Blaue Features sind nahe und rote Elemente sind tiefer in die Ebene der Seite. Diese Ansicht zeigt, dass lange Hyphen in halbregelmäßigen Intervallen, die subkolonien verursachen, seitliche Hefe-Formzellen absprudeln lassen. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie in der optischen Schnittung, Auflösung, Geschwindigkeit, Vermeidung oder Kompensation von Aberration, Mehrkanalerfassung und Rechenleistung haben zu einem Wiederaufleben der Bildgebung intakter Proben geführt. Bei festen Proben haben sowohl klassische als auch neuartige Klärungs- und Expansionsmethoden eine große Wirkung gehabt¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴. In diesem Fall haben wir einen schnellen und einfachen lösemittelbasierten Index-Matching-Ansatz angewendet, um die Struktur von Pilzbiofilmen zu untersuchen, die stark transluzent auf undurchsichtig sind.

Die vorhergehenden Protokolle wurden mit einer Reihe von Proben getestet. In unserem Labor Candida albicans Biofilme werden am häufigsten auf 14 mm Quadraten aus einem Blatt medizinischer Silikonkautschuk geschnitten (siehe Tabelle der Materialien). Dieses Substrat um wird verwendet, weil das Wachstum auf PDMS (Poly-Dimethylsiloxan) in flüssigem Kulturmedium als wichtiges In-vitro-Modell für Infektionen im Zusammenhang mit medizinischen Implantaten, insbesondere Indwelling Katheter, etabliert wurde. Gestresste Zellen, die eine Filamentierung einführen, haften schnell an unpolaren Oberflächen wie PDMS. In der Praxis geben gebrauchte Quadrate, die in einem Autoklaven (Trockenzyklus) gereinigt und resterilisiert wurden, die konsistentesten Biofilme für eine bestimmte Sorte. Biofilme werden auch häufig auf Deckgläsern, in Coverglasbodenkulturgerichten, in Standard-Bakteriologischen Polystyrolgerichten und auf Agar angebaut. Da C. albicans Zellen nicht gut an Glas haften, sollten Deckgläser mit einem Lektin behandelt werden, das Zellwandpolysaccharide bindet. Wir tragen 40 l von 1 mg/ml ConA oder WGA in sterilem Wasser auf jede deckfeste Oberfläche auf. Nach dem Trocknen werden die Deckgläser mit 40 l Glutaraldehyd für 3 min behandelt, um das Protein mit einem unlöslichen Film zu vernetzen. Sie werden dann mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, um das fixative und lösliche Lektin zu entfernen und luftgetrocknet. Bei Bedarf werden die behandelten Deckgläser oder Geschirr 10 min unter einer keimtötenden UV-Lampe resterilisiert.

Die Probendicke wirkt sich auf die erforderlichen Inkubationszeiträume in den Protokollen aus. Die fixative Diffusion in einen 300-m-Biofilm erfordert mehrere Minuten, um sich auszuausgleichen. Dieser Zeitraum nimmt mit dem Quadrat der Probendicke zu und sollte bei sehr dicken Biofilmen oder Agarblockproben, die 2–3 mm dick sein können, auf eine Stunde oder mehr verlängert werden. Die Ausgleichszeit für die Färbung hängt auch von der Probendicke ab, wie sie für die Fixierung und das Auswaschen beschrieben wird. Da die Lektine jedoch langsamer diffundieren als die Low-MW-Fixative, insbesondere innerhalb eines Agargels, sollte die Färbung über Nacht verlängert werden. Das gleiche sollte für das Auswaschen von überschüssigen Flecken getan werden.

Flecken verschiedener Art können in die Protokolle aufgenommen werden. Wir verwenden einen Zellwandfleck für die strukturelle Bildgebung, am häufigsten Calcofluor White M2R (Fluor. Aufheller #28) oder ein mit Farbstoffen versehenes Lektin wie ConA-Alexafluor 594 oder WGA-Alexafluor 594. Es sollte auf die Valenz des Proteins geachtet werden. Das ConA-Tetramer kann eine Vernetzung hochflexibler Hyphen im apikalen Bereich eines Biofilms verursachen. Dies ist beim WGA-Dimer weniger offensichtlich. Die kanonischen Besonderheiten dieser Marker sind Calcofluor für Chitin, ConA für Mannoserückstände und WGA für N-Acetyl-D-Glucosamin- und Sialinsäurerückstände.

Da das Lösungsmittelaustauschprotokoll von PBS oder Wasser durch Methanol zu Methylsalicylat abgestuft ist, müssen Probenbehälter lösungsmittelbeständig sein. Methylsalicylat (MS) wird Polystyrol-Kunststoff schnell erweichen und andere Kunststoffe langsam erweichen. Das Protokoll schritte bis zur Verwendung des ordentlichen Methanols kann in Kunststoffen durchgeführt werden, aber an diesem Punkt im Protokoll wechseln wir in der Regel auf Standard 20 ml Glasszintillationsfläschchen mit lösungsmittelbeständigen Schraubverschlüssen. Die Fläschchen eignen sich für Biofilme auf Silikonquadrat-Substrata, da die Quadrate mit einer feinen Pinzette aufgenommen und übertragen werden können. Außerdem kann eine Durchstechflasche entleert und mit dem flachen Quadrat auf der inneren gekrümmten Oberfläche aufgefüllt werden, so dass der Biofilm das Glas nicht in Berührung bringt. Das Substrat sollte Biofilm-up sein, wenn es in die aufrechte Durchstechflasche eingetaucht wird. Die Durchstechflaschen eignen sich hervorragend für die Langzeitlagerung von Proben.

Im Klärungsprotokoll minimieren abgestufte Lösungsmittelaustauschschritte das Risiko einer Probenverformung durch Lösungsmittelmischeffekte. Für Geschwindigkeit und Komfort im Basisprotokoll gibt es vier Schritte: 1) Schritt 3.3, PBS bis 50:50 PBS:methanol; 2) Schritte 3.4 und 3.5, PBS:Methanol zu sauberem Methanol, 3) Schritt 3.6, ordentlichm Methanol bis 50:50 Methanol:MS; und 4) Schritte 3.7 und 3.8, Methanol:MS bis ordentlich MS. Methanol sorgt für die Übergangsmiszerbarkeit. Da Wasser und MS jedoch nahezu unmischbar sind, ist es wichtig, dass das gesamte Wasser vor der Einführung einer MS durch Methanol verdrängt wird. Da Methanol sehr flüchtig ist, ist es wichtig, alle Methanole durch MS zu verdrängen. Die Verdunstung von Restmethanol führt zu Refraktiven Indexschwankungen innerhalb der Probe. Innerhalb der vierstufigen Sequenz ist es ratsam, den zweiten und vierten Schritt zu wiederholen, indem eine weitere Änderung des ordentlichen Lösungsmittels oder sogar eine dritte Änderung hinzugefügt wird. Bei besonders empfindlichen Proben könnten Lösungsmittelveränderungen in kleineren Prozentschritten formuliert werden.

Bei Agarblockproben können die Schritte 3.4 und 3.5 (neat methanol) das Auftreten von Salzkristallen innerhalb des Agars aufgrund der Unlöslichkeit von REST-PBS-Salzen im Methanol verursachen. Dies kann vermieden werden, indem destilliertes Wasser (DW) im ersten gemischten Lösungsmittelschritt anstelle von PBS verwendet wird, um Salze während des Wasser-Methanol-Austauschs zu verdünnen. Die alternative Lösungsmittelaustauschsequenz für feste Biofilme besteht dann aus folgenden Schritten: 1) Schritt 3.3, übertragen Sie die Probe von PBS in 50:50 DW:methanol (erlauben Sie zusätzliche Zeit für die Diffusion durch Agar); 2) Schritt 3.4, die Probe von 50:50 DW:Methanol in sauberes Methanol übertragen (2x mit Methanol wie in Schritt 3.5 wiederholen); 3) Schritt 3.6, die Probe von Methanol auf 50:50 Methanol übertragen:Methylsalicylat; und 4) Schritt 3.7, übertragen Sie die Probe von 50:50 methanol:MS auf ordentlichMS (wiederholen Sie 2x mit MS wie in Schritt 3.8).

Da Methylsalicylat Polystyrol-Kunststoffschnellundungen schnell erweicht, verwenden wir eine eloxierte Aluminiumschale mit einem Abdeckglasboden, um den geklärten Biofilm auf der Bühne eines invertierten Mikroskops zu halten. Das Deckglas wird mit UV-härtendem optischem Zement (Norland Optical Adhesive #61, siehe Materialtabelle) an Ort und Stelle gehalten. Sofern die MS am Ende des Tages durch Waschen der Schale mit Isopropanol gefolgt von Seifenwasser und Spülen entfernt wird, wird das zementierte Deckglas für viele Monate dienen.

Die objektive Linsenauswahl ist bei der großflächigen Abbildung geklärter Proben von entscheidender Bedeutung, da die Sphärische Aberration minimiert werden muss und ein ausreichender Arbeitsabstand erforderlich ist. Wir haben Erfahrung mit drei Zielen in diesen Studien. Im invertierten Mikroskop-Setup verwenden wir ein langes Arbeitsweg,moderate numerische Blende (NA) Objektivöl unter dem Deckglas mit dem Biofilm in Methylsalicylat in der Schale über dem Deckglas eingetaucht. Der größte Teil unserer Arbeit wurde mit einem achromatischen Objektiv der Zeiss Universal-Serie, Typ 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, durchgeführt, der mit einem negativen 160 mm Brennweitenadapter für die nominale Endloskonjugatkompatibilität (IC) verwendet wird. Dieses Ziel wurde ursprünglich für die Öl-Betrachtung durch 1,5-mm-Mikroskopschlitten mit 0,35 mm Arbeitsabstand²⁵entwickelt. Bei Verwendung mit einem Standard-Abdeckungsglas (0,17 mm) ist der Arbeitsabstand viel größer: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1.680 m. Wir verwenden auch ein neues Zeiss Multi-Immersion-Objektiv, Typ 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-Apochromat mit einem Arbeitsabstand von mehr als 540 m, wobei die Tauchkorrektur auf die hohe Seite des Öls eingestellt ist. Dieses Ziel ist stark korrigiert und erzeugt ein hervorragendes Bild. Auf einem aufrechten Mikroskopständer haben wir ein neues Nikon Multi-Immersion-Objektiv, Typ MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-Apochromat mit einem Arbeitsabstand von mehr als 5.000 m (5 mm), auch mit der Tauchkorrektur auf der hohen Seite von ‘Öl’ (n = 1.518) verwendet. Obwohl dieses Ziel eine niedrigere NA als die anderen hat, hat es den Vorteil, direkt in Methylsalicylat eingetaucht zu sein.

Um die Datenerfassung in Bezug auf Geschwindigkeit und Auflösung zu optimieren, sollten konfokale Mikroskopeinstellungen idealerweise sowohl die transveren als auch die axiale Nyquist-Probenahmedichte¹⁸erfüllen. Legen Sie den konfokalen Lochdurchmesser nach herkömmlichen Kriterien nominell auf 1 Luftiger Einheit fest. In vergrößerten Koordinaten

d_P (m) = 1,22 x Vergrößerung x (Emissionswellenlänge in m) / NA

Querabtasten (Pixelabstand) sollte die Auflösungsgrenze von Abbe nicht überschreiten (1/2) x abbe. In Objektraumkoordinaten

x, y = (Emissionswellenlänge in nm) / (4 NA)

Axiale Probenahme (Fokusinkrement) sollte die inverse axiale Bandbreite nicht überschreiten,

z = (Tauchindex) x (Emissionswellenlänge in nm) / (NA²)

Das konfokale optische System erweitert die Bandbreite des Mikroskops und schärft sowohl die Transveren- als auch die Axialauflösung um mindestens 1/2.

Für das 40x 0.85 NA-Objektiv, das wir am häufigsten verwenden, siehe Tabelle 1 für die Ergebnisse dieser Formeln für eine 600 nm Emissionswellenlänge (Alexa Fluor 594).

	Formel	x 1 /2	eingestellt (typisch)
d_P (m)	34,5 m	–	25 oder 50 m
X, Y	176 nm	125 nm	161 nm
z	1200 nm	848 nm	900 nm

Tabelle 1: Konfokaler Lochdurchmesser, Querentnahme und axiale Probenahmewerte für eine Emissionswellenlänge von 600 nm.

Mit einem Konfokusscanner mit diesen Einstellungen und einem 1.392 x 1.040 Pixel Scanfeld können Daten von Biofilmproben mit angemessener Geschwindigkeit und Auflösung erfasst werden. Typische einfarbige 3D-Bildstapel haben 0,35–1,55 GB.

Klärungsmedien im breiten Einsatz bereichen einen signifikanten Brechungsindexbereich. Durch Dunkelfeldbeleuchtung und Sichtprüfung stellten wir fest, dass feste C. albicans Biofilme oberhalb von n = 1,5 am transparentesten waren. Dies wurde durch Phasenkontrastmikroskopie auf n = 1.530–1.535 verfeinert. Aus einer Reihe praktischer Gründe verwenden wir Methylsalicylat (n = 1.537) als endgültiges Index-Matching-Lösungsmittel. Obwohl der Lösungsmittelaustausch das Risiko einer Probenverformung oder anderer Artefakte mit sich bringt, weisen Zellen in festen, geklärten Proben ähnliche Zellkörperabmessungen, einen Hyphendurchmesser und interseptale Längenmaße wie lebende Proben auf.

Viele Variationen im Lösungsmittelaustauschprozess sind möglich (z.B. mit einem anderen Übergangslösungsmittel oder einem anderen Endlösungsmittel). Methanol wurde aufgrund seiner hohen Polarität und schnellen Diffusion gewählt, aber Ethanol wurde gezeigt, dass es die Quantenausbeute²⁶ des roten fluoreszierenden Proteins (RFP) als Übergangslösungsmittel besser konservieren würde. Methylsalicylat wurde aufgrund seines Index, der moderaten Polarität, des niedrigen Dampfdrucks und der Kompatibilität mit vielen Flecken, Farbstoffen und fluoreszierenden Proteinen ausgewählt. Ein endgültiges Lösungsmittel mit etwas niedrigerem Index oder eine Mischung aus Methylsalicylat und einem niedrigeren Indexlösungsmittel, wie Butanol, kann jedoch besser dienen.

Unerwartet zeigt die Fähigkeit, einen Biofilm durchzusehen, nicht nur seine geschichteten inneren Merkmale, sondern hilft auch, den Ursprung erweiterter Strukturen wie lange, unverworrene apische Hyphen und invasive basalen Hyphen auf bestimmten Substraten zu betrachten. Opportunistische Virulenz bei C. albicans hängt von seiner genetischen Vielseitigkeit ab (d.h. Umstellung auf Hyphalwachstum, Upregulation von Zellsubstrat und Zellzellhaftung, Erzeugung von Osmolyten für Zellkeimen und Dehnung enrdung, und Verwendung alternativer Nährstoffe). Die Hyphal-Erweiterung ermöglicht den Ausbruch einzelner C. Albicans-Zellen aus phagozytischen Immunzellen, ist aber auch für die Invasion unerlässlich. Biofilmhaftung und Hyphenverflechtung scheinen die Oberflächenverankerung zu bieten, die für Hyphen erforderlich ist, um effizient in ein Substrat einzudringen. Wenn dieses Substrat um Wirtsgewebe ist, kann eine erhöhte Virulenz auftreten.

Die Abbildung intakter Biofilme ermöglicht eine Vielzahl von informativen Experimenten, bei denen Reporterstämme für die Genexpression, Modellgewebesubstrate und die Einbeziehung anderer Organismen wie Bakterien in natürlichen Biofilmen verwendet werden. Selbst im einfachsten Fall der rein strukturellen Bildgebung mit einem Zellwandfleck werden In-situ-Phänotypen aufgedeckt, die dann quantifiziert und genetisch analysiert werden können.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde teilweise durch NIH-Stipendien R01 AI067703, R21 AI100270 und R21 AI135178 an A.P. Mitchell unterstützt. Die Autoren sind Greenfield ‘Kip’ Sluder dankbar für die Bereitstellung des in dieser Arbeit verwendeten Ziels für das Eintauchen von Fernöl und Daniel Shiwarski für die konfokale Mikroskopie mit direkter Methylsalicylat-Immersion.

Materials

Biohazardous waste receptacle
Biosafety cabinet with germicidal UV lamp
Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol)
Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate
Distilled water			DW
Distilled water, sterile
Ethanol, absolute			EtOH
Fetal bovine serum (FBS), sterile
Fixative waste bottle in secondary containment
Formaldehyde 20% in water, ampules	Electron Microscopy Sciences
Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37%	Electron Microscopy Sciences
Fume hood
Glutaraldehyde 25% in water, ampules	Electron Microscopy Sciences
Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes
Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates
Isopropanol 70%			iPrOH 70%
Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt	Cole-Parmer Scientific		for curing NOA-61 cement
Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick	Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/		Non-reinforced medical grade silicone sheeting
Methanol 99.9%			MeOH
Methyl salicylate 99%			MS
Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets	Millipore Corp.	SX0001301
Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61	Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com	NOA-61
Orbital mixer, benchtop
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile
Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment)	Cargille Laboratories, https://cargille.com	Series E	Cedar Grove, NJ 07009, USA
RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile
Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner	Fisher Scientific Co.	03-341-25H	for specimen processing and storage
Solvent waste bottle in secondary containment
Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate
Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)
YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)

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Diesen Artikel zitieren

Lanni, F., Lagree, K., Huang, M. Y., Yan, L., Woolford, C. A., Mitchell, A. P. Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms. J. Vis. Exp. (157), e60718, doi:10.3791/60718 (2020).